Titane

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 470 (2023) Citer cet article

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Le développement de nouveaux biomatériaux dotés de propriétés mécaniques exceptionnelles et d'une biocompatibilité élevée a été un défi important au cours des dernières décennies. Les métaux nanocristallins ont fourni de nouvelles opportunités dans la production de biomatériaux à haute résistance, mais la biocompatibilité de ces nanométaux doit être améliorée. Dans cette étude, nous introduisons des nanocomposites métal-protéine en tant que biomatériaux à haute résistance avec une biocompatibilité supérieure. De faibles proportions d'albumine de sérum bovin (2 et 5% en volume), une protéine abondante dans le corps des mammifères, sont ajoutées au titane, et deux nanocomposites sont synthétisés à l'aide d'un processus de déformation plastique sévère de torsion à haute pression. Ces nouveaux biomatériaux présentent non seulement une dureté élevée similaire au titane pur nanocristallin, mais présentent également une meilleure biocompatibilité (y compris l'activité métabolique cellulaire, les paramètres du cycle cellulaire et le profil de fragmentation de l'ADN) par rapport au nano-titane. Ces résultats ouvrent une voie pour concevoir de nouveaux composites biocompatibles en utilisant des composés du corps humain.

Les biomatériaux reçoivent une attention considérable pour différentes applications ces dernières années. Le développement de biomatériaux métalliques pour les implants est particulièrement un enjeu critique tant du point de vue de la recherche que du point de vue technique en raison du contact direct des implants avec les tissus, les os et les fluides du corps humain sous charge. Le corps humain est un environnement très corrosif et complexe entraînant l'apparition de différents types de corrosion lorsqu'un matériau artificiel porteur est implanté dans le corps humain1,2,3. Le fluide corporel contient divers composés organiques et une variété notable de protéines. Il existe près de 105 protéines différentes disponibles dans le corps humain, chacune ayant un rôle spécifique. Parmi ces protéines, l'albumine serait la protéine la plus abondante dans le plasma et le liquide synovial4, et donc présente dans tout tissu humain où un matériau artificiel pourrait être implanté.

L'une des étapes initiales qui influence de manière significative la biocompatibilité est l'adsorption instantanée des protéines des fluides biologiques sur les surfaces des biomatériaux1,2. De plus, l'adsorption des protéines est considérée comme la première et la plus cruciale étape permettant l'adhésion des cellules à la surface du biomatériau et donc des phénomènes cliniques pertinents tels que l'ostéointégration des implants orthopédiques se déroulent au cours de cette étape1,2,3,4. L'albumine a été identifiée comme le liant métallique le plus puissant parmi les protéines du sang humain, ainsi, l'adsorption de l'albumine sur les surfaces des implants joue un rôle clé dans la détermination des fonctionnalités de surface telles que la biocompatibilité, la corrosion et la tribologie5. Les protéines créent une couche épaisse à la surface du matériau et les cellules détectent les surfaces étrangères à travers cette couche et commencent à réagir. Certains rapports sur les implants ont clairement révélé la présence de couches contenant des protéines à la surface1,6, indiquant l'importance de l'interaction des protéines avec les alliages biomédicaux au niveau cellulaire.

Le titane et ses alliages ont été largement utilisés comme biomatériaux potentiels dans de nombreux implants différents en raison de leur faible module élastique, de leur résistance élevée à la fatigue, de leur excellente résistance à la corrosion, de leur meilleure biocompatibilité par rapport à d'autres biomatériaux tels que les aciers inoxydables et les alliages Co-Cr7,8 et de leur faible densité de 4,5 g/cm3, soit environ la moitié des aciers inoxydables et des alliages Co-Cr9. Cependant, le principal inconvénient du titane et de ses alliages est leur résistance et leur dureté inférieures à celles des aciers inoxydables et des alliages Co-Cr7,8,9. Des études récentes ont montré que la nanostructuration du titane est une solution efficace pour améliorer sa résistance et sa dureté sans détériorer sa biocompatibilité10,11.

L'utilisation réussie des implants en titane dépend non seulement des propriétés mécaniques telles que le module d'élasticité et la dureté, mais également de l'ostéointégration à l'interface os-implant12. Cependant, en raison de la non-bioactivité des matériaux à base de Ti, ils ne peuvent pas se lier directement à l'os et favoriser la formation de nouvel os à leur surface dans les premiers stades de l'implantation13,14. Afin d'améliorer l'ostéointégration des matériaux à base de Ti, deux méthodes principales ont été employées basées sur des modifications de surface : (1) le contrôle de la topographie de surface avec changement physique et/ou chimique15,16 ; (2) l'immobilisation de molécules bioactives sur la surface de l'implant17,18. La deuxième approche, dans laquelle des revêtements riches en protéines telles que le collagène19 et l'albumine de sérum bovin (BSA)5,20,21,22 sont utilisés, peut améliorer la biocompatibilité des alliages à base de Ti.

Plusieurs études20,21,22,23,24 ont démontré les effets bénéfiques sur la biocompatibilité lorsque les alliages à base de Ti sont recouverts de protéines ou exposés à des solutions à fortes concentrations de BSA diluées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Dans les références 20, 21, 22, il a été démontré que le revêtement avec du BSA inhibe le dégagement d'hydrogène et les réactions de dissolution anodique, augmente la résistance des films protecteurs et améliore l'adhérence des cellules au titane pur et aux alliages à base de Ti tels que Ti-6Al-4V, Ti-6Al-7Nb et Ti-6Al-4V-1Zr (en % en poids). Dans le même sens, il a également été montré que la BSA améliore la stabilité du film passif d'alliage à des concentrations plus élevées dans l'alliage Ti-6Al-4V23. Dans le cas de l'alliage Ti-3Cu (en % en poids) exposé à une solution contenant des protéines de BSA24, la résistance à la corrosion était améliorée et la capacité antibactérienne était réduite lorsque la teneur en BSA augmentait dans la solution. Cependant, peu d'études25,26 ont révélé que l'adsorption d'espèces protéiques telles que la BSA à la surface des alliages à base de Ti peut améliorer la libération d'ions et entraver l'adhésion des cellules.

Malgré l'importance du revêtement protéique dans l'amélioration de la biocompatibilité des implants, ces revêtements riches en protéines ont une faible liaison au substrat métallique. En raison d'une liaison aussi faible, une délamination peut se produire au fil du temps, entraînant l'échec de cette technique de revêtement pour une implantation à long terme27,28. L'inclusion permanente d'une seconde phase comme des protéines dans le matériau métallique peut être une solution potentielle pour éviter le problème de délaminage des implants revêtus de protéines, mais il n'y a eu aucune tentative pour produire de tels composites métal-protéine.

Dans cette étude, pour produire des biomatériaux à haute résistance et bonne biocompatibilité pour une implantation à long terme, les particules de protéines sont directement insérées en deuxième phase dans du titane pur nanostructuré. Les nanocomposites massifs sont produits par une méthode de déformation plastique sévère de torsion à haute pression (HPT). Les matériaux présentent une dureté élevée et une meilleure biocompatibilité que le titane pur et ne souffrent pas de problèmes de délaminage, qui est un problème général de revêtement avec des protéines. Cette première introduction de biomatériaux composites métal-protéine ouvre une nouvelle voie pour un large éventail d'applications biomédicales.

De la poudre de titane avec un niveau de pureté de 99,9% et des tailles de particules inférieures à 45 μm et des poudres de BSA ont été utilisées pour préparer les biomatériaux. La BSA a été acquise auprès d'Amresco (Solon, OH, USA) avec une pureté de 98% et a été utilisée sans autre purification. La poudre de titane a été mélangée mécaniquement avec des particules de BSA dans les proportions de 0, 2 et 5 % vol. Les mélanges de poudre résultants, comme le montrent les Fig. 1a à c, ont ensuite été pré-consolidés sous une pression appliquée de 300 MPa en une forme de disque d'un diamètre de 10 mm et d'une épaisseur d'environ 1 mm à l'aide d'une presse hydraulique manuelle. La méthode HPT a ensuite été appliquée aux disques compactés pour préparer les nanocomposites massifs avec un bon niveau de mélange. La méthode HPT est une technique de déformation plastique sévère dans laquelle un échantillon en forme de disque est comprimé entre deux enclumes sous haute pression et une contrainte de cisaillement est induite en faisant tourner l'une des enclumes par rapport à l'autre, comme illustré à la Fig. 1d 29. Le processus HPT a été réalisé sous 2 GPa à température ambiante pendant 5 tours avec une vitesse de rotation de 1 tour par minute. La méthode HPT a été choisie pour la synthèse des composites pour trois raisons principales. (1) Cette méthode a été bien établie comme un processus capable de produire des matériaux nanostructurés avec une haute densité de défauts de réseau30,31,32,33,34. (2) La méthode peut être utilisée pour produire des composites en vrac à partir de mélanges de poudres à température ambiante33,34. (3) Les matériaux à base de Ti nanostructurés traités par HPT peuvent présenter à la fois une bonne biocompatibilité et une résistance élevée32,33,34,35.

( a, b ) images SEM en mode BSE et ( c ) cartographies élémentaires EDS correspondantes de Ti + 5 vol% BSA avant traitement HPT. (d) Schéma de la méthode HPT et de ses enclumes29. ( d, f, g ) Images SEM à différents grossissements en mode BSE pour Ti + 5 vol% de composite BSA après 5 tours de HPT sous 2 GPa.

Après le traitement HPT, les échantillons ont été polis en une surface semblable à un miroir pour les études microstructurales, mécaniques et de biocompatibilité. Les résultats des propriétés mécaniques et de la biocompatibilité des échantillons traités par HPT ont été comparés à un titane pur en vrac à gros grains de référence (99, 9%) avec une taille de grain moyenne de 200 μm qui a été recuit à 1073 K pendant 1 h.

La technique de microscopie électronique à balayage (SEM) a été utilisée pour étudier les caractéristiques de la microstructure au niveau du micromètre. Les images SEM ont été prises à l'aide des signaux d'électrons secondaires et rétrodiffusés (SE et BSE) sous une tension d'accélération de 15 kV avec un microscope JEOL JSM-7900F ou de 25 kV avec un microscope FEG Philips XL-30 équipé d'un détecteur de spectroscopie de rayons X à dispersion d'énergie (EDS) Bruker Nano X-Flash 6 | 60. Les images SEM ont été prises à 4 mm du centre des disques traités par HPT.

La microscopie électronique à transmission et à balayage-transmission (TEM et STEM) a été réalisée avec une tension d'accélération de 200 kV à l'aide d'un microscope à aberration corrigée (JEOL JEM-ARM200F). Pour TEM et STEM, des disques de 3 mm de diamètre ont été coupés de 2 à 5 mm du centre du disque traité HPT à l'aide d'une machine à décharge électrique. Les disques de 3 mm ont d'abord été broyés à une épaisseur de 100 µm par des papiers abrasifs et plus tard à une épaisseur plus petite pour la transparence électronique par un polisseur électrochimique à double jet conventionnel utilisant une solution de 5% HClO4, 25% C3H3(CH2)2CH2OH et 70% CH3OH, sous une tension de 12 V à une température de 263 K. ), images à champ noir annulaire à angle élevé (HAADF), diffraction électronique à zone sélectionnée (SAED) et cartographies EDS.

Pour l'analyse de la structure cristalline, les échantillons ont été examinés par la méthode de diffraction des rayons X (DRX) à l'aide d'un diffractomètre X'Pert Panalytical équipé d'un monochromateur en graphite fonctionnant à 45 kV et 40 mA avec un rayonnement Cu Kα (longueur d'onde de λ = 0,15406 nm).

Pour l'analyse des propriétés mécaniques, la microdureté Vickers a été mesurée en utilisant une charge de 500 gf et un temps de séjour de 15 s sur la surface supérieure des échantillons dans quatre directions radiales différentes du centre aux bords des disques traités par HPT.

La biocompatibilité a été évaluée par deux tests principaux : (1) dosage du bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) modifié ; (2) analyse du cycle cellulaire et du profil de fragmentation de l'ADN par cytométrie en flux. Dans la séquence, les détails des tests de biocompatibilité sont présentés.

Des lignées cellulaires de préostéoblastes de souris (MC3T3-E1) ont été maintenues dans du milieu essentiel Alpha Minimum (α-MEM) additionné de 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), de L-glutamine 2 mM, de pénicilline 100 U/mL et de streptomycine 100 μg/mL (Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA, États-Unis) dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2 à 310 K. Le MC3T Les cellules 3-E1 ont été fournies par l'Institut des sciences biomédicales de l'Université de São Paulo (USP), São Paulo, Brésil.

Les cellules MC3T3-E1 avec une confluence de 80% ont été trypsinisées puis inactivées avec α-MEM et comptées dans un compteur automatique Countess II (Thermo Fisher Scientific Inc., Walthan, MA, USA). Les disques traités par HPT ont été disposés dans une plaque à 24 puits (1 disque par puits). Les disques ont été stérilisés par exposition nocturne à la lumière ultraviolette dans une enceinte de sécurité biologique et 60 µL de suspension cellulaire (1 × 105 cellules) ont été étalés sur la surface des disques. La plaque a été incubée dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO2 à 310 K pendant une durée de 2 h. Ensuite, 1 mL de α-MEM a été ajouté à chaque puits et la plaque a été incubée dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2 à 310 K.

Le test MTT est utilisé pour mesurer l'activité métabolique cellulaire en tant qu'indicateur de la viabilité, de la prolifération et de la cytotoxicité des cellules. Le test MTT est basé sur la réduction d'un sel de tétrazolium jaune, le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) en cristaux de formazan violets par des cellules métaboliquement actives. Après 48 h de placage, les milieux de culture ont été aspirés et du MTT (0,5 mg/mL dans du PBS) a été ajouté aux cellules puis incubé pendant 3 h dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2 à 310 K. Le milieu de croissance a été déchargé et 250 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) ont été ajoutés à chaque puits pour dissoudre le MTT. L'absorbance de la lumière a été déterminée à 570 nm à l'aide d'un lecteur de plaque multipuits spectrophotométrique à balayage (F5 Microplate Reader, Molecular Probes).

Pour les essais de cytométrie en flux, les disques traités par HPT ont été placés dans une plaque à 24 puits (1 disque par puits), stérilisés à la lumière ultraviolette pendant 12 h et rincés dans une solution saline tamponnée au phosphate. Environ 1,8 × 105 cellules ont été étalées dans chaque disque. Après 48 h d'ensemencement, les cellules ont été récoltées et lavées avec du PBS. De l'éthanol froid (70 %) a été utilisé pour fixer les cellules pendant 30 min et 50 μg/mL d'iodure de propidium (PI) dilué dans du PBS contenant 1 mg/mL de RNase ont été utilisés pour colorer pendant 30 min. Les cellules ont été maintenues à température ambiante dans l'obscurité. Les pourcentages de cellules dans différentes phases du cycle ont été évalués par analyse par cytométrie en flux basée sur des noyaux colorés au PI à l'aide du logiciel Accuri ™ C6 (BD Biosciences).

Les figures 1a à c montrent des images SEM comprenant la cartographie élémentaire EDS d'éléments sélectionnés du disque compact avant le traitement HPT pour un composite contenant 5 % en volume de BSA. Dans ce cas, la surface de cet échantillon n'a reçu aucune procédure de polissage. Comme le montre le contraste de composition dans les images BSE (Fig. 1a, b), il existe un mélange raisonnable entre les particules de titane et de BSA au niveau du micromètre. Les particules grises font référence au titane avec des dimensions allant de 10 à 45 μm tandis que les particules noires font référence à la protéine BSA. Le BSA est un polymère linéaire contenant des atomes de C, H, O, N et S4. La cartographie élémentaire illustrée à la figure 1c confirme que les particules noires correspondent à la protéine BSA contenant des atomes de carbone entourés d'une matrice de titane.

Les figures 1e à g montrent des images de l'ESB pour le composite contenant 5 % en volume de BSA après traitement HPT. Comme indiqué par le contraste de composition et l'analyse EDS, les régions noires sont liées à la protéine BSA. Ces images montrent qu'après une déformation plastique sévère effectuée par traitement HPT, la protéine BSA est mélangée à des particules de titane formant des couches de protéines bien définies qui sont réparties sur tout l'échantillon, tandis que la phase de titane conserve son réseau tridimensionnel. La capacité du HPT à former une structure en couches de titane et de BSA est une conséquence de l'effet de contrainte de cisaillement sur l'évolution microstructurale balistique du titane et du BSA, tandis qu'une pression hydrostatique élevée facilite la co-déformation de deux composants avec des structures et des propriétés différentes. Cette capacité de la méthode HPT était déjà utilisée pour produire divers composites à base de Ti tels que les composites métal-métal36, les composites métal-céramique37 et les composites métal-carbone38. Ici, il convient de noter que les microstructures illustrées à la Fig. 1e – g ont également été observées lorsque le composite Ti-BSA a été examiné par MEB à partir de la vue en coupe, une caractéristique généralement observée dans les métaux traités par HPT30.

Les examens de la microstructure à un grossissement plus élevé à l'aide de STEM-HAADF et d'EDS, comme le montrent les Fig. 2a, b, confirment que le titane et la BSA ont une bonne liaison à l'échelle nanométrique. Bien que de futurs calculs théoriques soient nécessaires pour clarifier la nature de cette liaison, leurs caractéristiques devraient être similaires à celles observées pour l'absorption de protéines sur des implants en titane dans le corps humain. La liaison entre le titane et la protéine suit généralement deux étapes : (1) une liaison hydrogène et (2) un transfert de proton39. Certaines études ont suggéré qu'une telle liaison est renforcée par l'interaction du groupe OH avec le titane40,41, tandis que des simulations de dynamique moléculaire ont rapporté l'importance des interactions électrostatiques des groupes amide et carboxyle sur la liaison42,43.

Analyses STEM et TEM pour le composite Ti + 5 vol % BSA après 5 tours de HPT sous 2 GPa. (a) image HAADF et (b) et cartographie EDS correspondante avec Ti ; (c, f) images TEM-BF ; (d,g) modèles SAED correspondant à (c,f); et (c) image TEM-DF.

L'analyse TEM a été utilisée pour explorer davantage de caractéristiques de la microstructure du composite au niveau submicrométrique et nanométrique. La figure 2 montre des images TEM représentatives pour le composite avec 5 vol% de BSA après traitement HPT. Les images BF et DF (Fig. 2c, e) montrent la présence de plusieurs grains ultrafins de titane de tailles nanométriques ou submicrométriques avec une taille de grain moyenne de 90 nm. Le motif SAED (Fig. 2d) tiré de la région illustrée à la Fig. 2c montre des anneaux bien définis, suggérant la présence de grains ultrafins avec des orientations aléatoires dans la région sélectionnée. Les anneaux apparents de la Fig. 2d appartiennent au titane à structure hexagonale compacte (HCP). Une image BF (Fig. 2f) ainsi que le motif SAED respectif (Fig. 2g), tiré d'une région du composite contenant la protéine BSA, montrent la nature amorphe de la BSA qui est bien caractérisée par le motif en anneau halo montré dans le motif SAED.

La figure 3 montre les modèles XRD pour le titane pur et pour les échantillons contenant 2 et 5 % en volume de BSA après traitement avec HPT. Comme on peut bien le remarquer, les diagrammes XRD de tous les échantillons montrent la présence d'une seule phase qui se réfère à la structure hexagonale du titane (P63/mmc) en bon accord avec l'analyse TEM. Aucune nouvelle phase n'apparaît dans les modèles XRD après le traitement HPT. La seule différence entre les modèles XRD est liée à la diminution des intensités des pics XRD avec l'augmentation de la proportion de BSA.

Motifs XRD pour le titane pur et pour les composites contenant 2 et 5 vol% de BSA après 5 tours de HPT sous 2 GPa.

Pour avoir une idée des propriétés mécaniques des échantillons après l'ajout de protéine BSA par traitement HPT, la microdureté Vickers obtenue à 4 mm du centre des disques, où la contrainte de cisaillement est maximale, a été comparée. La figure 4 affiche les valeurs moyennes de microdureté pour les échantillons après traitement HPT. Les valeurs obtenues pour la microdureté sont assez similaires parmi les trois échantillons traités par HPT, ce qui montre que les petites additions de BSA jusqu'à 5% en volume n'influencent pas négativement la dureté. Les valeurs mesurées sont comprises entre 344 et 353 HV ce qui est en bon accord avec les valeurs trouvées dans la littérature pour les alliages à base de Ti traités par HPT34,44. La figure 4 montre que la dureté des composites Ti-BSA est plus de deux fois supérieure à la dureté du titane recuit à gros grains de référence.

Microdureté Vickers pour le titane pur et pour les nanocomposites contenant 2 et 5 vol% de BSA produit par 5 tours de HPT sous 2 GPa en comparaison avec la dureté du titane recuit à gros grains.

Ici, deux points doivent être mentionnés concernant les propriétés mécaniques. Premièrement, la dureté était la plus faible au centre des disques, mais augmentait avec l'augmentation de la distance par rapport au centre du disque, comme le montre la Fig. S1 des informations complémentaires. Ces hétérogénéités, qui sont dues à une augmentation de la contrainte de cisaillement avec l'augmentation de la distance du centre du disque, peuvent être évitées en augmentant le nombre de tours afin que les valeurs de dureté du centre du disque au bord saturent aux états stables29,30. Deuxièmement, alors que la consolidation des poudres de titane pur par HPT entraînait une limite d'élasticité en traction de 1 GPa et une ductilité de 12 %45, la présence de la phase protéique n'entraînait aucune ductilité sous tension, un fait généralement observé dans les composites céramo-métalliques. Malgré les bonnes performances mécaniques des composites sous charges de compression, leur ductilité limitée sous tension doit toujours être prise en compte lorsqu'ils sont utilisés pour toutes les applications, y compris les applications biomédicales46.

La viabilité cellulaire des nanocomposites après traitement HPT a été évaluée par des expériences de culture cellulaire in vitro utilisant les cellules MC3T3-E1. Les résultats de l'évaluation de la biocompatibilité via le test MTT sont présentés sur la figure 5. Il convient de noter qu'une absorbance de lumière plus élevée sur la figure 5 indique une activité métabolique cellulaire plus élevée. Tout d'abord, comme on peut le voir clairement sur la figure 5, tous les échantillons traités par HPT présentent une biocompatibilité supérieure par rapport à la référence en titane à gros grains. Dans le même sens, les références 32, 34, 35 ont également montré l'amélioration de la biocompatibilité des alliages à base de Ti après traitement HPT. De plus, parmi les échantillons traités par HPT sur la figure 5, les échantillons contenant de la BSA ont montré une biocompatibilité supérieure par rapport aux échantillons sans BSA. L'amélioration de la biocompatibilité dans les échantillons traités par HPT semble être proportionnelle à la teneur en BSA et l'échantillon avec 5 % en volume de BSA présente le meilleur comportement de biocompatibilité. Étant donné que les protéines adsorbées à la surface de l'implant interviennent dans les interactions cellule-surface, y compris sa différenciation et sa prolifération, on s'attend normalement à un meilleur processus d'ostéointégration et, par conséquent, à une excellente intégration tissulaire obtenue sur les nanocomposites Ti-BSA, en particulier dans les premiers stades de l'implantation.

Test de viabilité cellulaire MTT examiné par absorbance lumineuse à 570 nm pour le titane pur et pour les nanocomposites contenant 2 et 5 Vol% de BSA produit par 5 tours de HPT sous 2 GPa en comparaison avec la dureté du titane recuit à gros grains. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart type des expériences réalisées en quadruple et comparées par Kruskal – Wallis ANOVA et des comparaisons par paires par le test de Mann – Whitney.

La figure 6 montre le profil du cycle cellulaire des cellules MC3T3-E1 pour les échantillons traités par HPT, y compris un échantillon de référence en titane. Les cellules ont été colorées avec de l'iodure de propidium (PI), la fluorescence émise a servi de signal d'impulsion et la zone de signal (FL2-A) a été déterminée. Pour l'analyse du cycle cellulaire, 10 000 événements ont été collectés sur l'histogramme de FL2-A. Sur la figure 6a, les données PI sont sur un histogramme avec le nombre de cellules sur l'axe y et l'intensité de fluorescence PI sur l'axe x. L'histogramme montre le nombre de cellules dans trois phases différentes : G0/G1 ; S et G2/M pendant 48 h. Comme on peut l'observer sur la figure 6b, le nombre de cellules présentées dans les phases G0/G1, S et G2/M est assez similaire parmi tous les échantillons, ce qui indique que l'ajout de BSA n'a favorisé aucune distorsion ou anomalie telle que l'augmentation ou la diminution du nombre de cellules dans différentes phases du profil de cycle. En d'autres termes, le nombre de cellules dans chaque phase est maintenu inchangé pendant le profil du cycle indépendamment de la composition ou de la voie de traitement.

Profil du cycle cellulaire des cellules MC3T3-E1. (a) Histogramme représentatif des échantillons montrant la distribution des cellules dans les phases individuelles du cycle cellulaire dans les phases G0/G1 (bleu), S (rouge) et G2/M (vert). (b) Analyse quantitative de la distribution ou de la proportion du nombre de cellules dans chaque phase, réalisée à partir d'au moins 10 000 événements par échantillon. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart type des expériences réalisées en quadruple et comparées par Kruskal – Wallis ANOVA et des comparaisons par paires par le test de Mann – Whitney.

La figure 7 affiche la fragmentation de l'ADN des cellules MC3T3-E1 pour les échantillons traités par HPT comprenant une référence en titane. Sur la figure 7a, l'histogramme de la fragmentation de l'ADN cellulaire révèle que les échantillons présentent des valeurs comprises entre 1,5 et 2,0 % pour la fragmentation de l'ADN. Cela indique que l'ajout de BSA ou même le traitement HPT n'induit pas de comportement inattendu dans les échantillons, en particulier parce que les valeurs indiquées sur la figure 7b se situent à l'intérieur d'une plage très étroite pour prendre en charge tout changement significatif. Par conséquent, similaire à la conclusion tirée de l'analyse du cycle cellulaire, l'ajout de BSA au titane n'induit pas l'apoptose dans les cellules MC3T3-E1 en augmentant la fragmentation de l'ADN après avoir été traité par HPT.

Fragmentation de l'ADN des cellules MC3T3-E1. (a) Histogrammes représentatifs du pourcentage de fragmentation cellulaire. (b) Le nombre de cellules avec de l'ADN fragmenté est indiqué en pourcentage. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart type des expériences réalisées en quadruple et comparées par Kruskal – Wallis ANOVA et des comparaisons par paires par le test de Mann – Whitney.

Dans la présente étude, des nanocomposites métal-protéine à haute résistance et bonne biocompatibilité ont été introduits pour une implantation à long terme. Les nanocomposites sont des mélanges d'un métal biocompatible tel que le titane et de petites quantités d'une protéine endogène telle que 2 et 5 vol% de BSA. La méthode HPT a été choisie pour synthétiser ces nouveaux composites car la méthode assure un bon niveau de mélange à l'échelle du nanomètre entre les deux phases, et elle atteint la nanostructure souhaitable avec une dureté élevée pour les applications biomédicales.

La caractérisation initiale des nanocomposites métal-protéine réalisée par des analyses SEM, STEM, TEM et XRD a révélé des aspects microstructuraux intéressants de ces nouveaux biomatériaux. Les composites ont montré un bon niveau de mélange entre le titane et la protéine BSA ainsi que la présence d'une structure nanocristalline contenant des grains ultrafins de titane avec une taille de grain moyenne de 90 nm. La production de grains ultrafins et de matériaux nanocristallins qui présentent une dureté accrue est l'un des aspects les plus attrayants de HPT pour les applications de biomatériaux29,30,31,32,33,34,35. Aucune nouvelle phase n'a été identifiée dans les nanocomposites métal-protéine après le procédé HPT, ce qui indique que la dureté élevée est due à la nanostructuration et non à la formation de la phase ω-Ti45. En raison de ces caractéristiques microstructurales, les nanocomposites métal-protéine ont montré des niveaux de dureté deux fois supérieurs à la dureté du titane à gros grains de référence. De plus, l'ajout de BSA (jusqu'à 5% en volume de BSA) n'a pas influencé négativement la dureté, confirmant que l'ajout de protéines en petites quantités est une solution pratique pour développer des biomatériaux à haute résistance.

La biocompatibilité des nanocomposites métal-protéine après traitement HPT a été testée par des expériences de culture cellulaire directe utilisant les cellules MC3T3-E1. Les résultats ont montré que le nanocomposite métal-protéine contenant 2 et 5% en volume de BSA présentait une biocompatibilité supérieure par rapport aux références de titane pur nanocristallin et à gros grains. Au-delà de cela, le composite contenant 5% en volume de BSA a montré le meilleur comportement de biocompatibilité parmi tous les échantillons. D'autres aspects importants liés à l'interaction des cellules avec le nanocomposite métal-protéine ont également été mis en évidence dans le profil du cycle cellulaire et les résultats de la fragmentation de l'ADN. Ces tests ont indiqué des preuves claires que l'ajout de BSA au titane n'a induit aucune distorsion ou anomalie telle que l'augmentation ou la diminution du nombre de cellules dans différentes phases du profil du cycle et n'a pas non plus induit l'apoptose dans les cellules MC3T3-E1 en augmentant la fragmentation de l'ADN après avoir été traité par HPT. La biocompatibilité supérieure des nanocomposites métal-protéine peut être attribuée à la présence de protéines BSA dans l'ensemble du matériau, y compris leurs surfaces qui interagissent avec les cellules MC3T3-E1 montrant une excellente prolifération et adhésion cellulaire. Il convient de noter que bien que l'augmentation de la température pendant le HPT soit d'importance mineure pour conduire à la dénaturation thermique47,48, la dénaturation à froid et le processus de dépliement des protéines de la BSA peuvent se produire sous une pression élevée de 2 GPa, comme suggéré dans des publications antérieures49,50. Malgré ces changements structurels tridimensionnels possibles sous haute pression, le BSA reste efficace pour améliorer la biocompatibilité dans les composites Ti-BSA actuels.

Cet effet positif de biocompatibilité dû à la présence de BSA dans les alliages à base de Ti est en bon accord avec l'effet rapporté du revêtement protéique sur les implants20,21,22,23,24. Alors que les implants à revêtement protéique souffrent de délaminage depuis longtemps, la protéine BSA a été introduite en seconde phase dans le titane par consolidation à froid via le procédé HPT dans cette étude. Par conséquent, cette nouvelle famille de nanocomposites métal-protéine devrait être beaucoup moins sujette au problème de délaminage, bien que des tests à long terme soient nécessaires pour confirmer ce problème. Parce que la consolidation à froid par HPT est applicable à presque tous les types de composites, cette étude ouvre une voie pour la conception et la synthèse d'une large gamme de biomatériaux nanocomposites métal-protéine.

Dans cette étude, nous introduisons des nanocomposites métal-protéine en tant que nouveaux biomatériaux à haute dureté et excellente biocompatibilité. Les nanocomposites ont été synthétisés en mélangeant du titane métallique pur avec de l'albumine sérique bovine (BSA), une protéine endogène de mammifère, par torsion à haute pression. Les conclusions suivantes ont été tirées de cette étude.

La microscopie électronique a montré un bon niveau de mélange entre le titane et la protéine BSA, tandis que la taille des grains de titane était bien au niveau du nanomètre.

La microdureté des nanocomposites métal-protéine était similaire à celle du titane pur nanocristallin et plus de deux fois supérieure à celle du titane pur à gros grains.

La diffraction des rayons X a montré que l'ajout de BSA et le traitement ultérieur ne favorisaient pas la formation de nouvelles phases dans le matériau.

La viabilité cellulaire des échantillons, évaluée par des expériences de culture cellulaire in vitro utilisant les cellules MC3T3-E1, a montré que l'ajout de 5% en volume de BSA entraîne la meilleure biocompatibilité en raison de la prolifération cellulaire accrue favorisée par la présence de biomolécules de BSA.

L'ajout de BSA n'a favorisé aucune altération du profil cellulaire et de la fragmentation de l'ADN, indiquant que le biomatériau étudié ici serait une excellente option pour être utilisé comme implant à haute dureté et haute biocompatibilité.

Les ensembles de données générés pendant et/ou analysés pendant l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Ce travail est soutenu en partie par des subventions pour la recherche scientifique sur des domaines innovants du MEXT, Japon (JP19H05176, JP21H00150 & JP22K18737) et par la Fondation de recherche de São Paulo (FAPESP), Brésil (2019/06951-3). Nous tenons à remercier le professeur Cecilia Helena de Azevedo Gouveia de l'Institut des sciences biomédicales de l'Université de São Paulo (USP) pour avoir fourni les cellules MC3T3-E1.

École des sciences appliquées, Université de Campinas (FCA-UNICAMP), Pedro Zaccaria, Limeira, 130013484-350, Brésil

Ricardo Floriano, Karina Danielle Pereira et Augusto Ducati Luchessi

WPI, Institut international de recherche sur l'énergie neutre en carbone (WPI-I2CNER), Université de Kyushu, Fukuoka, 819-0395, Japon

Kaveh Edalati

Institut des biosciences, Université d'État de Sao Paulo (UNESP), Rio Claro, Sao Paulo, Brésil

Augusto Ducati Luchessi

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RF : Conceptualisation, Méthodologie, Validation, Rédaction ; KE : Conceptualisation, Méthodologie, Validation, Rédaction ; KDP : Méthodologie, Validation, Rédaction ; ADL : Conceptualisation, Méthodologie, Validation, Rédaction papier.

Correspondance à Ricardo Floriano.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Floriano, R., Edalati, K., Pereira, KD et al. Les nanocomposites titane-protéines comme nouveaux biomatériaux produits par torsion à haute pression. Sci Rep 13, 470 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26716-8

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Reçu : 20 juillet 2022

Accepté : 19 décembre 2022

Publié: 10 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-26716-8

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