Analyse structurale et fonctionnelle du système lymphatique du triton

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 6902 (2023) Citer cet article

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Les vertébrés capables de régénération tels que les tritons et les salamandres possèdent un système immunitaire adaptatif affaibli caractérisé par de multiples connexions entre le système lymphatique et le système vasculaire sanguin appelés cœurs lymphatiques. Le rôle de la vascularisation lymphatique et de ces connexions lymphatico-veineuses dans la régénération est inconnu. Nous avons utilisé la lymphangiographie in vivo dans le proche infrarouge, l'échographie à ultra-haute fréquence, la lymphangiographie micro-CT et la reconstruction par ordinateur tridimensionnelle de coupes histologiques en série pour évaluer les territoires lymphatiques de Cynops pyrrhogaster. Nous avons utilisé notre modèle et la supermicrochirurgie pour montrer que les cœurs lymphatiques ne sont pas essentiels à la circulation lymphatique et à la régénération des membres. Au lieu de cela, les tritons possèdent un nouveau réseau intra-osseux de lymphatiques à l'intérieur de l'os exprimant VEGFR-3, LYVE-1 et CD-31. Cependant, nous n'avons pas pu montrer l'expression de Prox-1 par ces vaisseaux. Nous démontrons que la moelle osseuse du triton adulte fonctionne à la fois comme organe de drainage lymphatique et comme réservoir de graisse. Cette étude révèle les différences anatomiques fondamentales entre le système immunitaire des urodèles et des mammifères et fournit un modèle pour étudier les lymphatiques et la régénération.

Le système lymphatique consiste en un réseau de vaisseaux lymphatiques, de tissus lymphoïdes et d'organes lymphoïdes qui constituent une partie importante du système immunitaire chez les vertébrés. Les vaisseaux lymphatiques commencent comme des vaisseaux aveugles dans les tissus et forment un réseau étendu dans tout le corps, mais n'ont pas encore été identifiés dans l'épiderme, le cartilage, ni dans les os sains. Tous les lymphatiques finissent par se drainer dans la circulation sanguine par des connexions lymphatiques-veineuses directes (lymphatico-veineuses).

Le système lymphatique fonctionne en régulant l'environnement environnant des cellules dans les tissus en contrôlant la disponibilité du liquide, des macromolécules et des globules blancs, formant un pont important entre les cellules, la matrice extracellulaire et le système vasculaire sanguin. Outre leur rôle traditionnellement reconnu dans le transport des fluides extracellulaires, des études récentes ont montré que les lymphatiques jouent également un rôle essentiel dans la cicatrisation des plaies, l'immunité, le métabolisme des graisses, les métastases cancéreuses, les maladies cardiovasculaires et métaboliques1,2,3,4,5,6. L'échec de la régénération du système vasculaire lymphatique à la suite d'une blessure entraîne un lymphœdème, une maladie défigurante caractérisée par un gonflement progressif des membres, un dépôt de graisse et des infections répétées à la cellulite qui affecte plus de 200 millions de personnes dans le monde et n'a pas de remède connu7.

Malgré la littérature croissante sur l'importance des lymphatiques dans la cicatrisation des plaies et la maladie, le rôle du système lymphatique dans la régénération reste peu étudié. Une raison majeure en est le manque de connaissance du système lymphatique chez les amphibiens urodèles (tritons et salamandres) largement considérés comme les meilleurs modèles de régénération des vertébrés en raison de leur capacité de régénération inégalée8. Une grande partie des connaissances actuelles sur les lymphatiques des urodèles est basée sur des études menées il y a plus d'un siècle et sur des hypothèses tirées de la recherche sur les anoures (grenouilles et crapauds)9,10,11.

Le système lymphatique de l'urodèle est caractérisé par la présence de 8 à 23 paires de cœurs lymphatiques (LH) situés au niveau des connexions lympho-veineuses le long du corps qui fonctionnent pour pomper la lymphe dans les veines et empêcher le reflux du sang dans les lymphatiques8,10,12. Les LH ne sont pas propres aux tritons. Les anoures ont 2 à 5 paires, tandis que les reptiles et les oiseaux possèdent une paire qui disparaît chez la plupart des oiseaux au début de la période post-embryonnaire10. Les mammifères, en revanche, ne possèdent pas de LH, mais le plexus veino-lymphatique initial qui se forme au cours du développement du sac lymphatique jugulaire a été décrit comme l'homologue vestigial du LH13,14. Par conséquent, les mammifères post-embryonnaires n'ont qu'une seule paire de connexions lymphatico-veineuses communes à tous les tétrapodes situées autour de la jonction des canaux thoraciques et des veines sous-clavières. Ces différences anatomiques significatives dans la circulation lymphatique des vertébrés ont des implications significatives sur la fonction du système lymphatique.

La diminution des connexions lymphatico-veineuses est remarquablement corrélée à une diminution de la capacité de régénération chez les vertébrés (Fig. i supplémentaire). La preuve de cette relation est très visible dans le cycle de vie des anoures. En tant que larves de têtards, ils partagent une structure lymphatique identique à celle des urodèles avec 8 paires ou plus de LH donnant un total d'au moins 18 connexions lymphatico-veineuses (y compris les connexions du canal thoracique aux veines sous-clavières). Au cours de cette phase de la vie, les têtards, comme les urodèles, possèdent la capacité de régénérer la queue, les membres et le cristallin de l'œil15,16,17. Ils subissent ensuite un déclin ontogénique, passant à un état incompétent pour la régénération à l'âge adulte avec un déclin correspondant du nombre de LH à 2 à 5 paires15,16,17. Des études sur la grenouille à griffes sud-africaine Xenopus laevis ont montré que les têtards jusqu'au stade 51 à 52 sont capables de régénérer un membre postérieur complet avec les 5 doigts après amputation17,18. Celle-ci décline progressivement à 3,7 chiffres en moyenne au stade 53 et à 2,5 au stade 55, accompagnée d'une perte progressive de l'expression sonic hedgehog dans le tissu en régénération17,18,19. Après la métamorphose, la régénération des membres postérieurs se limite à la formation d'un épi cartilagineux dépourvu de doigts ou de muscle18,20. L'étiologie de ce déclin progressif de la capacité de régénération chez les anoures et chez les vertébrés supérieurs tels que les mammifères reste inconnue, l'hypothèse principale attribuant ce déclin aux différences de réponse du système immunitaire aux blessures20,21,22,23,24. De plus, la question de savoir si la présence de ces multiples connexions lymphatico-veineuses facilite également la régénération reste inconnue.

Dans cette étude, nous avons défini l'anatomie lymphatique fonctionnelle du triton à ventre de feu japonais Cynops pyrrhogaster. Nous avons utilisé notre modèle pour montrer que contrairement aux anoures, les connexions lymphatico-veineuses LH ne sont pas essentielles à la circulation lymphatique et ne sont pas essentielles à la régénération. Au lieu de cela, les tritons possèdent un nouveau réseau intra-osseux de lymphatiques exprimant le récepteur 3 du facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGFR-3), le récepteur hyaluronane endothélial des vaisseaux lymphatiques 1 (LYVE-1) et le CD-31 qui relie les réseaux lymphatiques superficiels et profonds et maintient la circulation lymphatique même après l'excision de tous les LH. Il s'agit du premier rapport sur les lymphatiques dans les os sains et donne un aperçu des différences anatomiques fondamentales dans le système immunitaire des urodèles et des mammifères hautement régénératifs. Cette étude fournit également un modèle pour étudier le rôle de la vascularisation lymphatique dans la régénération et la régénération des lymphatiques chez les urodèles.

Notamment, il existe une variation considérable dans la nomenclature anatomique utilisée dans les urodèles. Cela est en grande partie dû à la rareté de la littérature sur l'anatomie vasculaire des urodèles et aux découvertes historiquement contradictoires des premiers chercheurs qui ont persisté. La monographie historique de Francis publiée en 1934, The Anatomy of the Salamander, comprend la description anatomique la plus détaillée du système vasculaire de la salamandre adulte à ce jour9. Par conséquent, la nomenclature utilisée dans cette étude est conforme à cette monographie9.

Nous avons d'abord évalué les territoires de drainage lymphatique in vivo à l'aide d'une lymphangiographie par fluoroscopie dans le proche infrarouge (NIRF) au vert d'indocyanine (ICG) complétée par une lymphangiographie de contraste par échographie à ultra haute fréquence (UHFUS) et par tomographie par micro-ordinateur (micro-CT). Le NIRF a une résolution élevée mais une faible profondeur de pénétration dans les tissus, tandis que l'UHFUS (40–70 MHz) est utile pour mesurer la taille et les taux de pulsation, mais a une résolution relativement faible et une faible profondeur de pénétration. Micro-CT d'autre part permet la visualisation des réseaux lymphatiques profonds pour compléter NIRF et UHFUS. Les vaisseaux lymphatiques collecteurs ont été définis fonctionnellement comme les plus grands vaisseaux lymphatiques collectant le flux distant.

Nous avons identifié 16 paires de LH latérales situées sur le dos du triton depuis les omoplates jusqu'à la base de la queue et numérotées ces LH1 à LH16 respectivement. L'ICG a rapidement coulé vers les LH 2 à 5 min après l'injection et a culminé en 10 à 15 min. Les membres et la queue étaient systématiquement drainés par des vaisseaux lymphatiques collecteurs bien définis dans des LH spécifiques (Fig. 1a). Dans le membre antérieur, les lymphatiques courent sur la face dorsale du membre en arrière d'un réseau axillaire puis drainés principalement dans LH2 et LH3, puis dans LH1, LH4 et LH5 via des connexions truncus lymphaticus logitudinalis lateralis (TLyLL). Des collecteurs lymphatiques sur la surface ventrale reliaient le réseau axillaire aux collecteurs de la tête et du membre antérieur controlatéral (Fig. 1b). De même, dans le membre postérieur, 2 lymphatiques collecteurs principaux sur le dos courent en arrière du bassin inférieur puis drainés dans LH11 et LH12 et plus tard dans LH8, LH9, LH10, ​​LH13, LH14, LH15 et occasionnellement LH16 via des connexions TLyLL (Fig. 1c). Les vaisseaux collecteurs courent également vers l'avant, traversant ventralement la ligne médiane et se connectant à un réseau autour du cloaque et aux collecteurs de la patte arrière controlatérale. La queue a été drainée par 2 collecteurs longeant la crête latérale sur les côtés gauche et droit qui se sont poursuivis vers l'avant pour former le TLyLL et drainés dans LH16 et plus tard LH15 (Fig. 1d, e).

Territoires lymphatiques cartographiés à l'aide d'une lymphangiographie fluoroscopique in vivo au vert d'indocyanine dans le proche infrarouge. ( a ) Diagramme montrant les territoires de flux lymphatique des membres antérieurs du triton (bleu), des membres postérieurs (jaune) et de la queue (vert) cartographiés à l'aide du vert d'indocyanine (ICG) près de la fluoroscopie infrarouge (NIRF). Les trunci lymphatici longitudinales lateralis (TLyLL) (têtes de flèches blanches) courent le long du corps interconnectant tous les cœurs lymphatiques (LH) (cercles verts). (b) Les lymphatiques des membres antérieurs (pointes de flèches bleues) passent en avant d'un réseau axillaire dense et sont principalement drainés dans LH2 et 3 (cercles verts) puis LH1, 3 et 5. La collecte des lymphatiques de l'aisselle a traversé la ligne médiane sur la surface ventrale pour rejoindre les collecteurs de la région de la tête et du membre antérieur controlatéral. Les sites d'injection ICG sont représentés par des pointes de flèches rouges. (c) Les lymphatiques des membres postérieurs (pointes de flèches jaunes) courent vers l'arrière et s'écoulent principalement vers LH11 et LH12 (cercles verts) puis vers LH8, 9, 10, 13, 14 et 15. Les lymphatiques des membres postérieurs sont connectés à un réseau dense autour du cloaque. Les lymphatiques du côté droit (d) et du côté gauche (e) de la queue (pointes de flèche vertes) ont été drainés par des vaisseaux lymphatiques ipsilatéraux respectifs, les collecteurs principaux à gauche et à droite suivant un parcours légèrement différent vers l'avant et ont formé le TLyLL de chaque côté. Le liquide lymphatique de la queue s'est écoulé dans LH16 (cercle vert) et plus tard LH15 à travers le TLyLL. ( f ) Diagramme montrant les territoires d'écoulement lymphatique du membre antérieur de la grenouille (bleu) et du membre postérieur (magenta) cartographiés à l'aide de l'ICG NIRF. Les grands sacs lymphatiques sous-cutanés (jaunes) reliant les lymphatiques des membres et la LH (cercles verts). ( g ) Le membre postérieur de la grenouille a été drainé principalement par des collecteurs dorsaux (pointes de flèche magenta) vers les LH postérieures (cercles verts) et un peu de liquide a coulé vers les grands sacs lymphatiques sous-cutanés (contour jaune). Les lymphatiques des membres antérieurs s'écoulaient rapidement dans les sacs lymphatiques obscurcissant la vascularisation lymphatique plus profonde avant de s'écouler vers les LH postérieures (pointes de flèche bleues). Les sites d'injection ICG sont représentés par des pointes de flèches rouges. Aucun sac lymphatique sous-cutané n'a été observé chez les tritons.

Chez Xenopus, le drainage des membres postérieurs se faisait principalement par des collecteurs dorsaux vers les LH et les sacs postérieurs (Fig. 1f, g). Dans le membre antérieur, l'ICG s'est rapidement accumulée dans de grands sacs lymphatiques sous-cutanés obscurcissant une vascularisation plus petite. Le liquide des sacs lymphatiques s'écoulait ensuite vers les LH postérieures. Nous n'avons pas trouvé de tels sacs lymphatiques chez les tritons. Au lieu de cela, un excès de colorant collecté dans les espaces extravasculaires, en particulier autour du tissu sous-cutané du bassin et de l'aisselle et le long des gaines nerveuses qui n'étaient pas tapissées d'endothélium, confirmé par l'absence de marqueurs endothéliaux VEGFR-3, LYVE-1 et CD-31 (Figs supplémentaires. ii et iii). Aucun liquide n'a été vu s'accumulant dans ces espaces lorsque de petites quantités de colorant de contraste ont été injectées, ce qui suggère que le flux lymphatique dans ces voies extravasculaires a un rôle limité dans la circulation physiologique. Aucun décès ou modification des mouvements ou du comportement alimentaire après l'administration d'ICG n'a été observé chez les animaux suivis jusqu'à 4 ans.

Le taux de LH au repos variait de 60 à 122 battements par minute (bpm) entrecoupés de périodes d'asystole et augmentait à 72–156 bpm après injection de 50 μL de colorant. Chaque LH battait indépendamment avec un rythme irrégulier et il n'y avait pas de synchronicité entre les LH adjacentes ipsilatérales ou controlatérales. Les taux de pulsation étaient généralement similaires dans tous les LH. L'injection de colorant dans une région a provoqué une augmentation simultanée du taux de tous les LH, y compris ceux ne partageant pas le même territoire de drainage sans collecte de colorant (données non présentées), suggérant un contrôle centralisé du système nerveux autonome.

Un modèle mathématique ellipsoïde (Fig. 2a) a été utilisé pour estimer la fraction d'éjection (EF) sur UHFUS et pour calculer le débit cardiaque LH (LHO) (Fig. 2b, c). L'EF moyen était de 60,40 %, l'EDV de 0,026 mm3, le taux de LH de 117,04 bpm, le LHO de 1,838 mm3/min par LH et le total combiné pour les 16 paires était de 58,816 mm3/min. Ainsi, les tritons sont remarquablement capables de pomper un volume de liquide lymphatique équivalent à leur masse corporelle de 5 à 6 g toutes les 1 à 2 h dans la circulation veineuse périphérique à un débit de 10 ml.Kg-1.min-1.

Calcul basé sur des ultrasons à ultra-haute fréquence du débit cardiaque du cœur lymphatique du triton. (a) La structure du cœur lymphatique (LH) consiste en une seule chambre musculaire recevant le liquide lymphatique des collecteurs lymphatiques et pompant ce liquide dans la veine de la veine latérale. Le LH a une valve d'entrée et une valve de sortie qui empêchent le reflux de sang. La reconstruction du volume 3D par ordinateur a montré que la forme du cœur lymphatique du triton se conformait le mieux à une forme de type ellipsoïde avec une extrémité de sortie légèrement pointue et une extrémité d'entrée aplatie, par conséquent, la fraction d'éjection (EF) a été calculée à l'aide d'un modèle mathématique ellipsoïde basé sur la mesure par ultrasons ultra-haute fréquence 2D du volume diastolique final LH (EDV) (b) et du volume systolique final (c) et du taux de LH. La FE moyenne était de 60,40 % (SD 12,94), la VDE de 0,026 mm3 (SD 0,008) et la fréquence cardiaque lymphatique moyenne était de 117,04 bpm (SD 23,12), ce qui donne un débit cardiaque LH (LHO) de 1,838 mm3/min pour chaque LH et un total combiné de 58,816 mm3/min pour les 16 paires.

Pour évaluer les réseaux lymphatiques profonds, nous avons effectué une lymphangiographie micro-CT qui a montré un écoulement de liquide lymphatique à travers la ligne médiane vers le côté controlatéral du corps à travers les côtes, les vertèbres et les lymphatiques vertébraux profonds (Fig. 3a). Nous avons procédé à l'évaluation de la microcirculation des tritons pour confirmer l'emplacement de ces voies lymphatiques alternatives à l'aide de coupes en série avec une reconstruction de volume informatique tridimensionnelle (3D) soutenue par l'immunohistochimie et la microscopie électronique à transmission (TEM). Pour assurer la clairance des globules rouges, prévenir l'effondrement des lumières des vaisseaux lymphatiques et pour une meilleure fixation, nous avons préparé le tissu pour la reconstruction du volume vasculaire 3D par fixation avec perfusion via le système lymphatique. La fixation par perfusion trans-lymphatique a utilisé la circulation lymphatique rapide, les multiples connexions lymphato-veineuses anatomiques et la rareté des valves veineuses qui permettent un flux bidirectionnel vers les lits capillaires pour fixer adéquatement le triton et prévenir l'effondrement des vaisseaux lymphatiques. Les urodèles ont 4 paires de gros vaisseaux lymphatiques collecteurs qui courent longitudinalement le long du tronc, le TLyLL qui longe les LH et les alimente directement, les trunci lymphatici longitudinales parabdominales (TLyLPab) et les trunci lymphatici longitudinales parepigastrici (TLyLPe) qui courent respectivement sur les couches sous-cutanées latérale et ventrale de la paroi du tronc, et les trunci lymphatici longitudinales subvertebrales (TLyLSv) qui sont les plus grands des quatre et s'enfoncent profondément dans le tronc immédiatement ventralement à la colonne vertébrale9.

Microcirculation du triton et réseau lymphatique médullaire intra-osseux. (a) La lymphangiographie micro-CT a montré un mouvement de contraste injecté dans le membre postérieur gauche (pointe de flèche rouge) circulant à travers des collecteurs (pointes de flèche jaunes) vers les cœurs lymphatiques (LH) (pointe de flèche verte) et dans l'os vertébral vers les collecteurs controlatéraux (pointe de flèche bleue), les LH controlatérales (pointes de flèche magenta) et les troncs lymphatici longitudinales lateralis (TLyLL) (pointes de flèche blanches). (b) L'unité lymphatique fonctionnelle répétée dans tout le tronc du triton. L'apport de LH du réseau lymphatique superficiel via le TLyLL et les lymphatiques intra-osseux vertébraux transverses (TvIL) reliant le réseau lymphatique profond au réseau lymphatique superficiel et aux LH des deux côtés du corps. (c) et (d) Reconstruction de volume 3D par ordinateur de section en série montrant les vaisseaux lymphatiques (vert) et les vaisseaux sanguins (rouge). Les TvIL (pointes de flèches jaunes) sont représentées circulant de l'os vers les LH. Les LH antérieures du tronc (c) étaient plus étroitement attachées à la côte adjacente tandis que dans la queue (d), elles étaient séparées des os par le muscle squelettique. (e) et (f) Immunohistochimie montrant des vaisseaux lymphatiques intra-osseux et des vaisseaux sanguins dans la moelle osseuse de l'apophyse transverse d'une côte abdominale (barres d'échelle = 100 μm) (e) et de la vertèbre caudale (barres d'échelle = 200 μm) (f). Les cellules endothéliales lymphatiques ont été identifiées par une forte absorption de rhodamine-dextrane et une coloration VEGFR-3 + , LYVE-1 + , CD-31 + tandis que les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins étaient CD-31 + , LYVE-1 ± , VEGFR-3- et une faible absorption de rhodamine-dextrane.

Le réseau lymphatique était fonctionnellement organisé en un réseau superficiel dermique et sous-cutané et un réseau viscéral profond avec quelques petits vaisseaux vus traversant la couche musculaire principalement dans les septa intermusculaires reliant les deux (Figs. Supplémentaires iv et v). Le réseau superficiel comprenait un fin plexus lymphatique dermique étroitement associé aux glandes à mucus et à poison de la peau et un plexus sous-cutané qui contenait le TLyLL, le TLyLPab, le TLyLPe et les collecteurs segmentaires du corps. Le réseau lymphatique profond comprenait le TLyLSv, le plexus vertébral des lymphatiques et les vaisseaux profonds longeant les principaux vaisseaux sanguins et nerfs dans les espaces intermusculaires pour rejoindre les lymphatiques viscéraux profonds intra-abdominaux et intrathoraciques se drainant finalement dans les veines principales du cœur sanguin. Aucun lymphatique n'a été observé dans l'épiderme. De même, aucun vaisseau sanguin n'a été observé dans l'épiderme. Au lieu de cela, les vaisseaux sanguins formaient un plexus sous-épidermique extrêmement riche et dense. Le muscle possédait également un vaste réseau de vaisseaux sanguins reliant les vaisseaux sanguins superficiels et profonds. La veine latérale latérale (VL) recevant la sortie de LH passe dans la couche sous-cutanée à côté du TLyLL.

Nous avons constaté que le LH avait 2 entrées principales, le TLyLL collectant les lymphatiques superficiels et un nouveau réseau lymphatique intra-osseux dans l'os se connectant aux lymphatiques profonds du TLyLSv (Fig. 3b). Le réseau lymphatique intraosseux consistait en un vaisseau lymphatique collecteur principal que nous avons appelé le vaisseau lymphatique intraosseux vertébral transverse (TvIL) à l'intérieur des apophyses transverses vertébrales et des côtes accompagné de 1 à 2 veines reliant la sortie VL LH au plexus veineux sous vertébral, nous les avons appelés les veines intraosseuses vertébrales transverses (TvIV) (Fig. 3c, d, Vidéos 1 et 2). Le TvIL et le TvIV avaient de petites branches et affluents formant un réseau à l'intérieur de la moelle osseuse se connectant au périoste et au muscle environnant. Les veines avaient nettement plus de tributaires et étaient caractérisées par la présence de plusieurs valves dirigeant le flux sanguin médialement vers le plexus veineux sous-vertébral. Outre les 2 valves aux extrémités d'entrée et de sortie des LH, aucune autre valve n'a été observée dans le système vasculaire lymphatique, ce qui permet un écoulement de liquide bidirectionnel facile et une réponse rapide aux changements de la circulation lymphatique.

La présence d'un réseau lymphatique intra-osseux fonctionnel a été confirmée par l'absorption de colorant rhodamine-dextran dans les vaisseaux VEGFR-3 + , LYVE-1 + , CD-31 + (Fig. 3e, f). L'analyse TEM (Fig. 4a – d) a également confirmé l'ultra-structure des vaisseaux lymphatiques à l'intérieur de la moelle osseuse et les a comparés aux vaisseaux sanguins25.

Ultra-structure des vaisseaux lymphatiques et veineux intra-osseux et du cœur lymphatique. ( a ) Section de numérisation colorée au bleu de toluidine incrustée de résine d'une côte abdominale de triton montrant les lymphatiques intraosseux vertébraux transverses (TvIL) ( b ) et les veines intraosseuses vertébrales transversales ( TvIV ) ( c ) à l'intérieur de la moelle osseuse et le cœur lymphatique adjacent ( LH ) ( d ). La microscopie électronique à transmission a confirmé que la TvIL ((b) barre d'échelle = 2 μm) et la LH ((d) barre d'échelle = 20 μm) étaient tapissées de cellules endothéliales lymphatiques (LEC) avec les caractéristiques ultra-structurales caractéristiques de l'endothélium lymphatique, notamment l'absence de péricytes, des parois minces et un cytoplasme LEC très atténué (têtes de flèches vertes (b)), avec des jonctions serrées clairsemées, peu de jonctions adhérentes, occasionnellement espaces entre les LEC (pointes de flèche jaunes (b et d')) et les jonctions de cellules endothéliales en forme de feuille qui se chevauchent (pointe de flèche bleue (d')). Le muscle LH spécialisé présentait des caractéristiques à la fois du muscle cardiaque et du muscle squelettique (tête de flèche blanche (d')). En revanche, les TvIV ((c) Barre d'échelle = 5 μm) étaient tapissés de cellules endothéliales sanguines (BEC) avaient des parois plus épaisses, entourées de péricytes (pointes de flèche magenta (c)) avec plusieurs jonctions serrées et jonctions adhérentes (pointes de flèche rouges (c)) et avaient de multiples vésicules cytoplasmiques. Des globules rouges ont également été observés dans les vaisseaux sanguins.

Cette structure constituée des collecteurs lymphatiques superficiels, amenant la lymphe des segments périphériques du corps vers les LH via le TLyLL, le TvIL transportant la lymphe entre les lymphatiques profonds et les LH, et les LH pompant la lymphe dans le VL, formait l'unité lymphatique fonctionnelle de base qui se répétait sur tout le tronc du triton (Fig. 3b). Dans les lymphatiques antérieurs drainant le membre supérieur, la poitrine et l'abdomen, la TvIL passait à l'intérieur des côtes et était le plus grand vaisseau d'entrée prédominant de la LH tandis que dans la queue, les collecteurs superficiels drainant les membres postérieurs et la queue étaient prédominants. Les LH antérieures (Vidéo 1) étaient également plus étroitement attachées à la face dorsale postérieure de la côte adjacente tandis que dans la région de la queue (Vidéo 2), elles étaient situées légèrement plus loin des os séparés par un muscle squelettique. L'analyse en coupe en série de tous les os des membres antérieurs et postérieurs, des côtes et des vertèbres du cou, du tronc et de la queue proximale, de la ceinture scapulaire et de la ceinture pelvienne a montré que la moelle osseuse du triton était hautement vasculaire, hypocellulaire et largement remplie de tissu adipeux (Figs. supplémentaires vi et vii).

Les LH sont essentielles à la circulation lymphatique chez les anoures13,26,27. L'interruption expérimentale de leur fonction par anesthésie ou ablation entraîne une hémoconcentration, un œdème et la mort inévitable des grenouilles et des crapauds en 2 à 4 jours13,26,27. Pour évaluer la fonction différentielle de LH chez les tritons et les xénopes, nous avons effectué des excisions supermicrochirurgicales incrémentielles de LH. Conformément aux rapports précédents 13, 26, 27, l'excision des 2 paires de LH postérieures chez Xenopus a entraîné un œdème, une prise de poids postopératoire (PO) de 18 à 29% et la mort dans les 12 h chez toutes les grenouilles malgré la présence de LH antérieures intactes (Fig. viii supplémentaire). Fait intéressant, aucun des tritons n'a développé d'œdème, n'a changé de comportement ou n'est décédé au cours de la période d'observation de 1 mois à 1 an après l'excision de la LH régionale ou des 16 paires de LH (Fig. 5a).

Modifications physiologiques de la circulation lymphatique après exérèse cardiaque lymphatique. ( a ) L'excision des cœurs lymphatiques (LH) chez les tritons n'a pas provoqué d'œdème, de modifications histologiques ni de décès (barres d'échelle = 1 mm). Il n'y avait pas de différence significative dans les diamètres des membres postopératoires (PO) à 1 semaine (t proximal (9) = 0,729, p = 0,485, moyen t (9) = − 0,504, p = 0,627, distal t (9) = 0,297, p = 0,773) entre les tritons excision LH et les témoins avec une bonne fiabilité inter-évaluateurs ICC = 0,893, 95 % IC (0,825, 0,934). ( b ) La lymphangiographie micro-CT a montré un contraste lymphatique réduit dans la circulation sanguine chez les tritons excision LH à 90 jours PO, avec un flux collatéral Trunci lymphatici longitudinales parabdominales (TLyLPab) observé (têtes de flèches jaunes). L'analyse de la veine cave postérieure (VCP) a montré que les tritons excision LH avaient une valeur de gris moyenne significativement inférieure (t (34) = − 3,156, p = 0,003) à celle des témoins. ( c ) L'analyse par lymphangiographie par fluorescence à la rhodamine-dextran du flux lymphatique vers veineux (barres d'échelle = 100 μm) a également montré une diminution significative de la densité des vaisseaux sanguins recevant du liquide lymphatique (t (188) = 13, 057, p <0, 001) à 28 jours après l'excision de tous les LH, mais cela est revenu à la normale à 120 jours PO (t (161) = - 0, 854, p = 0 .394). ( d ) L'échographie à ultra-haute fréquence a montré une augmentation significative (t (12) = - 2, 707, p = 0, 019) du taux de LH chez les tritons ayant subi une excision postérieure bilatérale de la LH. ( e ) Le flux collatéral a maintenu la circulation lymphatique après l'excision des LH. Le collatéral TLyLPab est affiché (pointes de flèche jaunes) avec des connexions au TvIL (pointe de flèche magenta). Ces résultats ont confirmé que l'excision de la LH a interrompu avec succès le flux lymphatique périphérique vers veineux pendant 90 jours, après quoi le flux lymphatique vers veineux normal a été restauré après 120 jours PO. Les données représentent la moyenne ± l'écart type (barres d'erreur).

L'évaluation quantitative du flux lymphatique vers veineux a été réalisée par micro-CT quantitatif de la veine cave postérieure (VCP) (Fig. 5b) et en mesurant la densité des vaisseaux sanguins intramusculaires qui avaient reçu le colorant rhodamine-dextran des lymphatiques (Fig. 5c). Le VCP est une veine majeure avec un parcours régulier en tritons. Contrairement à d'autres veines majeures, nous avons constaté que le VCP, tout comme les vaisseaux sanguins intramusculaires, n'était pas accompagné de plusieurs gros vaisseaux lymphatiques, ce qui les rend idéaux pour étudier le flux lymphatique périphérique à veineux. Les tritons excision LH avaient un flux lymphatique-veineux significativement plus faible à 28 jours PO (p < 0,001) et à 90 jours (p = 0,003) qui a augmenté à des valeurs normales après 120 jours (p = 0,394) confirmant que l'élimination de la LH a effectivement mis fin aux connexions lymphatico-veineuses et réduit le flux lymphatique-veineux.

Pour déterminer pourquoi les tritons n'ont développé aucun symptôme de dysfonctionnement lymphatique après l'excision de LH, nous avons effectué une évaluation circulatoire physiologique après l'excision de certains ou de tous les LH. L'UHFUS a montré que le taux de pompage des LH antérieures restantes chez les tritons ayant subi une excision des LH postérieures était significativement plus élevé que celui des témoins (Fig. 5d). Cette augmentation compensatoire de l'activité LH a augmenté de manière correspondante la production de chaque LH de 20 %, mais la production combinée globale des 9 paires restantes (41,454 mm3/min) était encore inférieure à la production combinée chez les tritons normaux. La lymphangiographie micro-CT des tritons excision LH a montré l'élargissement des vaisseaux lymphatiques collatéraux dans le plan sous-cutané s'étendant longitudinalement et transportant le liquide lymphatique vers les TvIL (Fig. 5b, e).

Pour confirmer si les LH se régénèrent, nous avons effectué une série de dissections microchirurgicales in vivo, UHFUS et micro-CT lymphangiographie après l'excision complète des LH simples et multiples. La régénération a suivi systématiquement 5 stades morphologiques (Fig. 6a – e). Après la résolution du caillot, une angiogenèse robuste et une restauration de la structure des principaux vaisseaux sanguins ont été observées pour la première fois au cours des 28 à 60 premiers jours PO (Fig. 6a – e). Cela a été suivi par une lymphangiogenèse de 50 à 80 jours PO (Fig. 6e, f) et une régénération complète des LH de 100 à 130 jours PO (Fig. 6g), les LH de la queue plus caudale prenant un peu plus de temps pour se régénérer complètement et reprendre le pompage que les LH du tronc plus crânien. Les LH régénérées avaient une taille, une forme, une structure, un emplacement et une fonction identiques à ceux de la LH d'origine, y compris des valves et un débit entièrement fonctionnels, démontrés par l'absorption de colorant rhodamine-dextran (Figs. 6g et 7). Les cellules endothéliales lymphatiques nouvellement régénérées (LEC) avaient une forte expression de VEGFR-3, LYVE-1 et CD-31 (Fig. 7).

Stades morphologiques de la régénération cardiaque lymphatique après exérèse complète. (a) Cœur lymphatique normal (LH) (pointes de flèche magenta) avec son nerf d'alimentation (pointes de flèche bleues), les trunci lymphatici longitudinales lateralis (TLyLL) (pointes de flèche noires) et veineux lateralis (VL) (pointes de flèche rouges). La fonction LH a été confirmée par la collecte de rhodamine-dextran (barres d'échelle = 100 μm). (b) Le défaut tissulaire immédiatement après l'excision de LH. Un segment du TLyLL, du VL et du nerf fournisseur, qui sont tous intimement associés à la LH, ont également été réséqués. (c) Étape 1 Post-opératoire (PO) Jour 5 à 10 : la formation de caillots a été suivie par l'accumulation d'une masse de tissu mou et fragile sous l'épiderme de la plaie. (d) Stade 2 PO Jour 28–40 : Angiogenèse de plusieurs petits vaisseaux sanguins interconnectant les extrémités coupées du VL et les autres principaux vaisseaux sanguins. Aucune lymphangiogenèse observée au site de la blessure. L'histologie montrait des muscles et des fibroblastes en régénération mais pas de lymphatiques fonctionnels sans collection de rhodamine-dextran. (e) Stade 3 PO Jour 50-60 : Maturation des vaisseaux sanguins rétablissant leur taille et leur structure d'origine et restauration de la continuité de la CV. On a observé de petits vaisseaux lymphatiques jaillissant des bords de la plaie vers la zone de blessure. ( f ) Stade 4 PO Jour 80–100: Maturation des vaisseaux lymphatiques avec flux actif et collecte de colorant observée sous forme de masse kystique dans la région de la LH d'origine, mais pas de pulsations. (g) Stade 5 PO Jour 100–130 : Régénération complète de la LH avec pulsation. Les LH régénérés avaient des vannes d'entrée et de sortie entièrement fonctionnelles et une absorption de rhodamine-dextran confirmant qu'ils étaient entièrement fonctionnels.

Expression du marqueur des cellules endothéliales lymphatiques dans les lymphatiques nouvellement régénérés. Coupes histologiques montrant le cœur lymphatique régénéré (LH) (tête de flèche jaune) et l'os costal adjacent (tête de flèche bleue) dans la région abdominale 120 jours après l'excision microchirurgicale complète. Les LH nouvellement régénérées avaient une forme, une taille, une structure, une position et une fonction identiques à celles de la LH d'origine. De plus, la LH nouvellement régénérée a démontré une forte expression des marqueurs de cellules endothéliales lymphatiques VEGFR-3 et LYVE-1 et du marqueur pan-endothélial CD-31. L'absorption de colorant rhodamine-dextran a confirmé que les lymphatiques étaient entièrement fonctionnels (barres d'échelle = 200 μm).

Un essai contrôlé randomisé a été réalisé pour évaluer la fonction des connexions lymphatico-veineuses LH dans la régénération des membres à l'aide du modèle lymphatique des membres postérieurs. Une excision supermicrochirurgicale incrémentielle de LH9 à LH15 a été réalisée chez les tritons de l'étude et une opération fictive chez les témoins, suivie d'une amputation du membre postérieur gauche (Fig. 8a). Les deux groupes avaient une longueur moyenne du museau à la queue similaire, groupe d'étude (101,55 mm, SD 4,57) et témoins (101,97 mm, SD 4,82) t(60) = − 0,352, p = 0,726, et un poids corporel moyen similaire, groupe d'étude (5,37 g, SD 1,22) et les témoins (5,45 g, SD 1,17) t(60) = −0,245, p = 0,808. Tous les tritons ont reçu le traitement expérimental assigné. Le suivi a été complet chez 52 tritons dont 10 tritons, 4 d'étude et 6 témoins, incapables de récupérer complètement de l'anesthésie et décédés suite à l'intervention chirurgicale mais cette différence n'était pas significative p = 0,732. Il n'y avait pas de différence significative dans le temps nécessaire pour atteindre chacune des étapes de régénération entre les tritons de l'étude et les témoins. Le nombre moyen de jours pour atteindre le critère d'évaluation du stade d'excroissance digitale était de 47,81 jours (ET 8,56) dans le groupe d'étude et de 47,52 jours (ET 10,137) chez les témoins, p = 0,773 (Fig. 8b). Une analyse plus approfondie des sous-groupes n'a montré aucune différence statistiquement significative entre l'excision unilatérale et bilatérale de la LH, et entre l'amputation le même jour que l'excision de la LH et l'amputation retardée d'une semaine (Fig. 8c – i).

Essai contrôlé randomisé évaluant le résultat de l'excision cardiaque lymphatique sur le taux et la morphologie de la régénération des membres. (a) La conception de l'essai contrôlé randomisé : n = 62 tritons ont été inscrits et séparés en 4 blocs, chaque bloc a été randomisé en un groupe d'étude et de contrôle par un assistant indépendant en aveugle. Le suivi a été complet chez 52 tritons, 10 tritons sont décédés immédiatement après l'opération. ( b ) Il n'y avait pas de différence statistiquement significative dans le taux global de régénération entre les groupes d'étude et de contrôle (Kolmogorov – Smirnov Z = 0, 662, p = 0, 773). ( c – h ) L'analyse des sous-groupes n'a également montré aucune différence statistiquement significative dans les taux de régénération entre l'étude et les tritons témoins après excision unilatérale de la LH (Kolmogorov – Smirnov Z = 0, 730, p = 0, 660), quel que soit le moment de l'amputation amputation immédiate après l'excision de la LH ( Kolmogorov – Smirnov Z = 0, 617, p = 0, 841) et amputation retardée 1 semaine après l'excision de la LH (Kolmogo rov–Smirnov Z = 0,661, p = 0,774). De même, aucune différence significative entre l'étude et les tritons témoins n'a été trouvée après excision bilatérale supplémentaire de la LH (Kolmogorov–Smirnov Z = 0,778, p = 0,579) quel que soit le moment de l'amputation amputation immédiate (Kolmogorov–Smirnov Z = 1,284, p = 0,074) et amputation retardée 1 semaine PO (Kolmogorov–Smirnov Z = 1,193, p = 0,11 6). (i) La comparaison des tritons d'étude d'excision LH des différents lots expérimentaux (à l'exclusion des témoins) n'a également montré aucune différence significative dans le temps nécessaire pour terminer la régénération (Kruskal – Wallis H(3) = 0,1.229, p = 0,746). ( j ) La comparaison des anomalies morphologiques dans les membres régénérés n'a montré aucune différence statistiquement significative (p = 0, 150) entre les tritons d'étude et de contrôle. Les données représentent la moyenne ± l'écart type (barres d'erreur).

Moins de tritons dans le groupe d'étude ont développé des anomalies dans les membres régénérés par rapport aux témoins, mais cette différence n'était pas statistiquement significative (Fig. 8j). Les anomalies des membres les plus fréquemment observées étaient les duplications de doigts (n = 6 tritons) et les doigts manquants (n = 4 tritons).

La microchirurgie reconstructive lymphatique du lymphœdème a établi que, tout comme les angiosomes des vaisseaux sanguins, la vascularisation lymphatique, malgré ses interconnexions étendues, est également organisée en unités fonctionnelles avec des collecteurs lymphatiques spécifiques drainant préférentiellement un bloc tridimensionnel spécifique de territoire tissulaire également appelé lymphosome28,29,30. La définition de ces territoires est essentielle pour la compréhension de l'anatomie fonctionnelle, du développement embryologique, du traitement microchirurgical et pour la modélisation expérimentale du système lymphatique. Dans cette étude, nous avons évalué l'anatomie lymphatique fonctionnelle du triton et révélé un nouveau réseau lymphatique à l'intérieur de la moelle osseuse reliant les réseaux lymphatiques superficiel et profond. Nous avons utilisé notre modèle et notre supermicrochirurgie de précision pour montrer que les multiples connexions lymphatico-veineuses LH qui sont une caractéristique distinctive importante des systèmes lymphatique et immunitaire des tritons et d'autres vertébrés hautement compétents en régénération (Fig. i supplémentaire) ne sont pas essentielles à la régénération. De plus, nous avons démontré que les tritons sont capables de régénérer une LH entièrement fonctionnelle après une excision complète dans un processus par étapes caractéristique. Par conséquent, les tritons fournissent un modèle utile pour étudier à la fois le rôle de la vascularisation lymphatique dans la régénération et la régénération des lymphatiques. Cependant, les différences anatomiques notables entre les urodèles, les anoures et les mammifères trouvées dans cette étude doivent être prises en compte dans la traduction des résultats.

Historiquement, la recherche lymphatique a pris du retard par rapport à celle des vaisseaux sanguins car les vaisseaux lymphatiques sont généralement plus petits, difficiles à visualiser sans l'utilisation de colorants de contraste et partagent de nombreux marqueurs moléculaires avec les vaisseaux sanguins, ce qui les rendait difficiles à distinguer avant l'avènement des marqueurs LEC Prox-1, VEGFR-3, LYVE-1 et podoplanine. Panizza a été le premier à étudier les lymphatiques des salamandres en 1883 en utilisant le mercure comme agent de contraste, mais cela a été fortement critiqué pour avoir provoqué la déformation d'espaces lymphatiques plus grands en raison de son poids et a été remplacé par des colorants liquides et semi-gélatineux9,10. Ces méthodes n'étaient pas adaptées à une utilisation in vivo et révélaient peu de choses sur l'anatomie lymphatique fonctionnelle. Nous avons utilisé ICG NIRF comme modalité principale complétée par une lymphangiographie UHFUS et micro-CT pour définir les territoires lymphatiques des membres antérieurs, des membres postérieurs et de la queue du triton in vivo et avons validé notre modèle en montrant une diminution du flux lymphatique vers veineux après excision de LH. Ces régions ont été sélectionnées pour créer des modèles lymphatiques car elles sont les plus largement utilisées dans la recherche sur la régénération. Une limitation majeure du NIRF que nous avons observée chez les tritons et les grenouilles est que leurs pigments de peau foncés absorbent la lumière proche infrarouge. Par conséquent, nous avons dû utiliser des animaux albinos transgéniques, ce qui a par la suite limité la taille de nos échantillons.

Nos résultats ont montré que le système lymphatique des urodèles est considérablement différent de celui des anoures. Bien que les 60,40 % de FE que nous avons trouvés chez les tritons LH étaient comparables aux 20 à 80 % rapportés chez les anoures, les taux de LH et de FE des tritons n'ont pas montré de grande variation avec l'état de vigilance de l'animal26,31. La production combinée totale résultante de 10 ml.Kg−1 min−1 des 16 paires de LH chez les tritons était également le double des 0,9–5 ml.Kg−1 min−1 estimés circulant dans tous les anoures LH26. Paradoxalement, contrairement aux anoures, ni l'anesthésie générale complète ni l'excision complète de certains ou de tous les LH chez les tritons n'ont entraîné de dysfonctionnement lymphatique ou de mort, le flux collatéral étant rapidement mobilisé à la place et la circulation rétablie. Ce recrutement de collatéraux suite à l'interruption de certains grands collecteurs lymphatiques est partagé par la plupart des autres vertébrés, à l'exception des anoures. À cet égard, le système lymphatique des urodèles partage anatomiquement plus de similitudes avec d'autres classes de vertébrés que celui des anoures adultes. De plus, nous avons montré que les tritons ne possèdent pas les grands sacs lymphatiques sous-cutanés caractéristiques des anoures adultes10,32. Le résultat de la biologie unique chez les anoures signifie que leur flux lymphatique dépend fortement du mouvement musculaire et de la ventilation pulmonaire pour le flux de lymphe périphérique dans les sacs lymphatiques et dépend également de leurs LH pour le drainage de la lymphe dans la circulation sanguine. Ainsi, le système lymphatique des anoures représente une adaptation de diversion hautement spécialisée pour répondre aux besoins uniques de l'architecture corporelle des anoures plutôt que le modèle amphibien exclusif de progression évolutive.

De manière frappante, nous avons identifié un nouveau réseau intra-osseux de lymphatiques dans la moelle osseuse de tritons normaux reliant le réseau lymphatique superficiel, le plus grand plexus vertébral profond et les LH. Le passage préférentiel de ces vaisseaux à travers la cavité osseuse assure une protection mécanique contre l'affaissement de la lumière vasculaire. Ce vaste réseau a maintenu la circulation lymphatique même après le retrait de tous les LH, empêchant le dysfonctionnement lymphatique chez les tritons. Notamment, nous n'avons pas pu utiliser l'expression de Prox-1 pour l'identification des LEC malgré de multiples tentatives dans des conditions expérimentales variables. Par conséquent, nous avons adopté une approche multimodale combinant une reconstruction 3D par ordinateur de coupes en série avec une lymphangiographie micro-CT soutenue par une analyse de l'expression des cellules endothéliales VEGRF-3 et LYVE-1, des études d'injection de colorant TRITC-dextran et une analyse TEM pour démontrer de manière exhaustive la présence d'un réseau de vaisseaux lymphatiques dans les os vertébraux et les côtes (Figs. 3 et 4). Cependant, la coloration Prox-1 est toujours nécessaire pour prouver définitivement l'identité lymphatique des vaisseaux VEGFR-3 + et LYVE-1 + dans les vertèbres, les côtes et les os longs (Fig. v supplémentaire).

Bien qu'il s'agisse d'un organe lymphoïde primaire clé du système lymphatique chez de nombreux vertébrés, la vascularisation lymphatique osseuse n'a été identifiée que dans des états pathologiques tels que les tumeurs osseuses vasculaires et les tumeurs osseuses malignes primaires et secondaires étendues33,34,35. L'aversion osseuse des mammifères pour les vaisseaux lymphatiques est mise en évidence de manière plus spectaculaire dans la maladie de Gorham-Stout, un trouble mal compris caractérisé par l'apparition de vaisseaux lymphatiques dans les os conduisant à une résorption osseuse hautement destructrice et progressive entraînant la disparition totale de l'os affecté36. Nos résultats montrent que malgré la présence de lymphatiques, l'os de triton adulte n'est ni un organe lymphoïde primaire ni secondaire37,38, mais fonctionne plutôt comme un organe de drainage lymphatique important et un réservoir de graisse chez les tritons. Nous supposons que les lymphatiques peuvent également fonctionner dans le métabolisme et la mobilisation de cette réserve de graisse de la moelle osseuse.

Contrairement au système immunitaire inné, le rôle du système immunitaire adaptatif dans la régénération des tritons est mal compris. Les analyses de scRNA-seq dans l'axolotl ont systématiquement identifié les marqueurs de cellules T et B tac et igll5 à des étapes critiques de la régénération des membres39,40,41. Cependant, notre résultat ne montrant aucun changement significatif dans la régénération après l'excision des principaux composants du système vasculaire du système lymphatique du triton, conformément aux rapports précédents sur l'excision du plus grand organe lymphoïde secondaire, la rate, suggère fortement que la réponse immunitaire adaptative peut ne pas être essentielle pour la régénération mais peut plutôt avoir un rôle régulateur42.

Le lymphœdème est le résultat direct d'une altération de la fonction vasculaire lymphatique. Les mécanismes précis derrière l'échec de la régénération lymphatique après une blessure par chirurgie et chimioradiothérapie restent inconnus43. La cicatrisation et la fibrose médiées par le TGF-β1 ainsi que la sclérose et la perte d'activité de pompage des lymphatiques collecteurs sont reconnues comme des étapes précipitantes dans la physiopathologie du lymphœdème43,44. Outre la LH, les vaisseaux lymphatiques des amphibiens sont dépourvus à la fois des parois musculaires pulsantes et des valves observées chez les mammifères collecteurs lymphatiques45. Cet attribut rend les LH idéales pour modéliser les aspects structurels et fonctionnels des lymphatiques collecteurs humains. Notamment, contrairement au muscle lisse trouvé chez les collectionneurs de mammifères, la musculature LH du triton partage les caractéristiques du muscle squelettique et cardiaque13,46. Nous avons montré que les tritons sont capables de régénérer la LH après excision complète. La forte expression de VEGFR-3 dans les LEC nouvellement régénérées suggère que, comme chez les mammifères, la régénération lymphatique chez les tritons peut également dépendre de la voie VEGF-C/VEGFR-347. Nous supposons que les dommages de l'innervation peuvent être la raison pour laquelle les LH plus caudaux ont retardé la reprise de l'activité de pompage. Des études sur des grenouilles ont montré que le pompage des LH prend 20 à 30 jours pour récupérer après la dénervation46. La régénération observée de la vascularisation sanguine précédant les lymphatiques rappelle le développement embryologique des lymphatiques exprimant Prox-1 qui poussent à partir des vaisseaux sanguins48,49. Les études futures devraient se concentrer sur la source des LEC dans les LH en régénération, l'expression spatio-temporelle différentielle de Prox-1, LYVE-1, VEGFR-3, SOX18 et d'autres facteurs associés à la lymphangiogenèse, ainsi que les facteurs qui influencent la récupération complète de l'activité de pompage.

Cliniquement, la création microchirurgicale d'anastomoses lymphatico-veineuses (LVA) seules ou en tant que LVA efférentes dans les transferts de ganglions lymphatiques vascularisés sont maintenant largement considérées comme le principal traitement chirurgical du lymphœdème et des troubles du flux lymphatique50,51,52,53. Celles-ci fonctionnent un peu comme les connexions lymphatico-veineuses LH naturelles des tritons. Par conséquent, nous avons concentré notre étude sur ces connexions car elles présentent une opportunité facilement disponible pour la traduction chirurgicale des avantages thérapeutiques possibles chez les patients au-delà de la circulation des fluides. L'absence d'association de connexions lymphatico-veineuses avec la régénération trouvée dans cette étude offre un aperçu préliminaire de la biologie des tissus cicatrisants après LVA. Cependant, l'association étroite des connexions lymphatico-veineuses du triton LH avec les lymphatiques osseux intra-osseux, qui sont naturellement absents chez l'homme, présente un rappel conséquent des différences de physiologie lymphatique entre les tritons et l'homme. Aborder les fonctions immunologiques et métaboliques de ce réseau lymphatique intra-osseux peut donner un aperçu de l'absence évolutive de lymphatiques dans l'os humain, de leur rôle dans la maladie, l'immunité, le métabolisme des graisses et éventuellement dans la régénération.

Des tritons à ventre de feu japonais adultes albinos de type sauvage et transgénique Cynops pyrrhogaster de 90 à 120 mm de longueur du museau à la queue ont été obtenus auprès de la Faculté des sciences de la vie et de l'environnement de l'Université de Tsukuba54. Des grenouilles sud-africaines à griffes de type sauvage et albinos Xenopus Laevis ont été obtenues dans une animalerie locale. Les tritons de type sauvage et toutes les grenouilles étaient hébergés au Département de chirurgie plastique de l'Université de Mie, tandis que les tritons albinos étaient hébergés à la Faculté des sciences de la vie et de l'environnement de l'Université de Tsukuba. Toutes les expériences impliquant des animaux ont été réalisées conformément aux directives et aux règlements approuvés par le comité de protection des animaux de l'Université de Mie et le comité de protection et d'utilisation des animaux de l'approbation de l'Université de Tsukuba (code d'enregistrement 170110). Toutes les méthodes ont été réalisées et rapportées conformément aux directives ARRIVE 2.055.

Les animaux ont reçu une anesthésie avec une solution à 0,1 % de FA100 (4-allyl-2-méthoxyphénol ; DS Pharma Animal Health, Osaka, Japon) dans de l'eau à température ambiante pendant 1 à 2 h avant les procédures expérimentales56.

Une lymphangiographie ICG NIRF a été réalisée sur des tritons albinos transgéniques54 (n = 9 tritons) et des grenouilles albinos (n = 3 grenouilles). L'injection sous-cutanée à l'aide d'une aiguille 34G de 10 à 20 μL d'une solution 1:1000 Diagnogreen 25 mg/ml (Daiichi Sankyo, Tokyo, Japon) diluée avec de l'eau stérile pour injection a été utilisée pour évaluer le flux lymphatique dans des conditions physiologiques normales et 50 μL ont été utilisés pour évaluer le drainage de liquide tissulaire en excès. Les injections des surfaces dorsale et ventrale de la main (membre antérieur) et du pied (membre postérieur) et des côtés gauche et droit des 10 à 15 mm distaux de la queue ont chacune été évaluées séparément. Le flux lymphatique a été visualisé et enregistré à l'aide d'une caméra PDE Neo NIRF (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City, Japon) à fort grossissement tenue à 15–25 cm des animaux.

L'immunohistochimie a été réalisée comme décrit précédemment par Casco-Robles et al.57. En bref, les échantillons ont été lavés dans du PBS, 0, 2% de TritonX-100 dans du PBS et à nouveau dans du PBS pendant 15 min chacun, incubés dans une solution de blocage (2% de sérum de chèvre normal (S-1000; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) / 0, 2% de TritonX-100 dans du PBS) pendant 2 h, lavés comme précédemment, puis incubés dans un anticorps primaire dilué dans une solution de blocage. Pour la coloration VEGFR-3, le tTBS a été utilisé à la place du PBS. Des études de colorant fluorescent ont été réalisées à l'aide de tétraméthylrhodamine-dextran 2 000 000 MW (Invitrogen D-7139) reconstitué dans de l'eau stérile pour injection injectée par voie sous-cutanée 20 à 50 μL et des échantillons de tissus récoltés 10 à 15 minutes plus tard. Les vaisseaux lymphatiques ont été identifiés et différenciés des vaisseaux sanguins en comparant l'absorption différentielle de rhodamine-dextrane et la coloration différentielle de VEGFR-3, LYVE-1 et CD-31. Les LEC ont été identifiées comme VEGFR-3 + , LYVE-1 + , CD-31 + et BEC identifiées comme CD-31 + , LYVE-1 ± , VEGFR-3-. Une identification supplémentaire des vaisseaux lymphatiques par coloration avec des anticorps Prox-1 disponibles dans le commerce chez des tritons adultes matures a été tentée dans des conditions expérimentales variables, mais cela a échoué (données non présentées). Les images d'histologie ont été capturées à l'aide d'un microscope Keyence BZ-X710 et d'un Olympus AX80 couplé à un appareil photo numérique pour microscope Olympus DP74. Le traitement d'image a été effectué à l'aide de l'image J58,59.

Les anticorps suivants ont été achetés, Anti-LYVE-1 Novus (NB600-1008), Anti-CD-31 Bioss (BS-0195R), Anti-LYVE-1 Abcam (Ab14917). L'anticorps anti-VEGFR-3 a été fabriqué sur mesure sur la base de l'orthologue du nucléotide newt par Eurofins Japan. De plus amples détails sur les anticorps utilisés sont fournis dans les données supplémentaires.

Après l'anesthésie, 50 μL de colorant ICG ont été injectés par voie sous-cutanée dans les membres ou la queue des tritons et des grenouilles. Une incision cutanée longitudinale a été pratiquée sur le dos immédiatement en dessous de la crête de la ligne latérale recouvrant les LH à retirer à l'aide d'un scalpel chirurgical n ° 15 et un lambeau cutané de 2 à 3 mm de large a été soulevé dans le plan sous-cutané à l'aide de la technique de dissection de supermicrochirurgie et des microscopes chirurgicaux OMS 800 et OMS 610A (Topcon, Tokyo, Japon) pour préserver les perforateurs des vaisseaux sanguins cutanés. Les LH ont été identifiés visuellement par pulsations et collecte de colorant ICG. Les LH ont été excisées à l'aide d'une technique de supermicrochirurgie et d'instruments en titane de supermicrochirurgie (EMI Factory CO., Ltd. Nagano, Japon) pour préserver soigneusement les tissus environnants dans le groupe d'étude tandis que chez les témoins, une chirurgie identique a été effectuée mais les LH sont restées intactes. Les lambeaux cutanés ont été fermés à l'aide de sutures interrompues en nylon 10/0.

Un total de 62 tritons ont été inscrits dans l'essai contrôlé randomisé et divisés en 4 blocs conçus pour évaluer la régénération après l'excision incrémentielle de LH et la régénération après le début des changements circulatoires à 1 semaine PO. Les tritons ont ensuite été randomisés en groupes expérimentaux à peu près égaux à l'aide de SPSS 26 par un assistant aveugle et indépendant (du département de chirurgie HPB). Des tests T indépendants ont été utilisés pour comparer la longueur moyenne du museau à la queue et le poids des deux groupes. Les 7 LH drainant le membre inférieur ont été identifiées chez tous les tritons et excisées à l'aide de la technique supermicrochirurgicale décrite ci-dessus dans le groupe d'étude, tandis que chez les témoins, une dissection identique a été réalisée mais les LH sont restées intactes. Le membre postérieur gauche a été amputé de 2 mm en amont de l'articulation du genou à l'aide d'un scalpel chirurgical n° 10 et le fémur saillant a été coupé au ras de la plaie. Une légère pression a été appliquée pendant quelques minutes pour obtenir l'hémostase. La mise en aveugle des investigateurs n'a pas été possible en raison de la nature chirurgicale du traitement expérimental. Cependant, pour limiter les biais, le groupe assigné n'a été révélé aux microchirurgiens qu'après exposition de la plaie et microdissection lymphatique. Les tritons ont été maintenus à vide dans des récipients en plastique séparés à température ambiante, observés quotidiennement et le stade morphologique de régénération enregistré60. Notre protocole original prévoyait l'évaluation du temps de régénération des membres par 3 investigateurs en aveugle. Cependant, nous nous sommes écartés du protocole en raison de la disponibilité limitée du personnel entre 2020 et 2021 et à la place, un seul enquêteur non aveugle a effectué cette évaluation. Le taux de régénération a été comparé entre les groupes d'étude et de contrôle à l'aide du test de Kolmogorov-Smirnov à deux échantillons. Le test de Kruskal-Wallis a été utilisé pour l'analyse en sous-groupe des tritons excision LH du groupe d'étude. L'évaluation de la morphologie des membres régénérés a été réalisée par 2 chercheurs en aveugle. Le test exact de Fisher a été utilisé pour comparer les proportions de membres régénérés anormaux morphologiques et de décès par PO.

Chez les tritons (n ​​= 6 tritons du groupe d'étude, n = 5 tritons témoins), le diamètre de la patte arrière gauche a été mesuré en 3 points ; 3 mm en amont de l'articulation de la cheville, au niveau de l'articulation du genou et dans la cuisse 2 mm en amont du genou 1 semaine après l'excision de LH par 2 assistants indépendants en aveugle. Le coefficient de corrélation intraclasse a été calculé sur la base d'un modèle d'évaluation moyenne (k = 2), d'accord absolu et à effets mixtes à 2 facteurs. Pour les grenouilles (n = 2 grenouilles), les grenouilles ont été essuyées avec une serviette en papier pour éliminer l'excès d'eau et le poids corporel total a été mesuré à l'aide d'une microbalance numérique.

La densité des vaisseaux intramusculaires positifs à la rhodamine-dextrane a été évaluée en comptant le nombre de vaisseaux dans un champ de 20 × sur 24 à 36 coupes transversales différentes en paraffine de la base de la queue, de l'abdomen et de la poitrine de chaque triton. N = 3 tritons ont été évalués 28 jours après l'excision de tous les LH, n = 1 triton évalué après 120 jours et n = 3 tritons témoins 28 jours et 120 jours après une opération fictive. Des tests T indépendants ont été utilisés pour comparer les densités de vaisseaux entre les groupes.

La lymphangiographie micro-CT a été réalisée à l'aide de CosmoScan GXII (Rigaku, Tokyo, Japon) avant et 10 à 60 min après l'injection sous-cutanée de 10 à 50 μL d'Iohexol (Omnipaque®300, GE Healthcare Pharma, Tokyo, Japon) et les images ont été traitées à l'aide du logiciel RadiAnt DICOM Viewer. L'analyse quantitative du PCV a été effectuée à l'aide de l'image J59. La valeur grise moyenne de la section transversale du VCP a été mesurée à 6 points différents le long de son parcours du bassin au foie dans chaque triton et un test T indépendant a été utilisé pour comparer l'étude (n = 3 tritons) et le groupe témoin (n = 3 tritons).

L'UHFUS a été réalisée sur 6 tritons (n ​​= 2 tritons normaux, n = 2 tritons de résection LH, n = 2 tritons d'opération de contrôle) à l'aide de VeVo MD UHF70 (FUJIFILM Visualsonics, FUJIFILM, Tokyo, Japon) avant et après l'injection de 20 à 50 μL de solution saline dans les membres. Un total de n = 8 LH de 2 tritons ont été utilisés pour calculer LH EF. Un total de n = 3 LH de 2 tritons d'étude et n = 11 LH de 1 contrôle et 2 tritons normaux ont été utilisés pour la comparaison de la compensation du taux de LH après excision de la LH postérieure à l'aide d'un test T indépendant.

Pour l'excision d'une seule LH (n = 5 tritons), un lambeau cutané de 2 × 4 × 2 mm a été élevé dans la queue proximale et une seule LH a été excisée à l'aide de la technique supermicrochirurgicale décrite ci-dessus. La régénération a été évaluée en ouvrant le lambeau cutané à des intervalles hebdomadaires, puis mensuels pendant 150 jours. Pour l'excision multiple de LH, n = 1 triton après l'excision des 16 paires de LH et n = 16 tritons du groupe d'étude de l'expérience de régénération des membres ont été observés entre 100 et 150 jours en ouvrant des lambeaux cutanés le long de la zone où les LH ont été retirés et en utilisant la lymphangiographie micro-CT. Une lymphangiographie à la tétraméthylrhodamine-dextrane et une IHC ont été réalisées sur des coupes histologiques en série à 28 jours (n = 3 tritons) et 120 jours (n = 1 triton).

FixLyP a été réalisé pour éliminer les globules rouges des vaisseaux sanguins et fixer les vaisseaux lymphatiques pour empêcher leur effondrement en vue de la reconstruction de volume 3D par ordinateur de lames en série. Une incision cutanée abdominale médiane a été pratiquée en prenant soin de ne pas pénétrer dans le péritoine. Le VCP (diamètre 0,3–0,5 mm) a été identifié lors de sa remontée du bassin vers le foie immédiatement en profondeur jusqu'au péritoine à l'aide d'un microscope opératoire. Le péritoine a été ouvert, des pinces microvasculaires de petite taille ont été appliquées de manière proximale et distale, et la veine a été coupée à 5 mm avant qu'elle n'entre dans le foie. L'extrémité céphalique de la veine a été préparée en utilisant une technique microchirurgicale standard pour disséquer l'adventice. Une aiguille vasculaire émoussée à bout rond microvasculaire a ensuite été insérée dans l'extrémité céphalique de la veine et les pinces vasculaires ont été libérées. Une solution saline d'héparine froide à 4 ° C a été lentement injectée dans la veine à l'aide d'une seringue de 1 ml permettant à l'extrémité caudale de la veine de saigner librement jusqu'à ce que la couleur du foie devienne blanchâtre et qu'une solution saline d'héparine claire s'écoule. Ensuite, du paraformaldéhyde (PFA) froid à 4 % à 4 °C a été injecté lentement à raison de 20 à 50 μL/poids corporel (g)/min dans le tissu sous-cutané des membres et de la queue jusqu'à ce que le corps du triton devienne rigide. Les échantillons ont ensuite été prélevés et placés immédiatement dans du PFA froid à 4% pendant 4 h puis déminéralisés à l'aide d'EDTA pendant 2 jours.

Des sections en série incrustées de paraffine de 5 μm d'épaisseur ont été colorées avec HE et numérisées à 20 × à l'aide d'un scanner de diapositives numérique NanoZoomer S360 (Hamamatsu Photonics K. K, Hamamatsu, JAPON). La reconstruction de volume par ordinateur numérique 3D de 900 lames en série de l'abdomen et de la queue a été réalisée à l'aide du plugin Image J (FiJi Version 1.53f51) TrakEM258,59. Dans les cas où une section de tissu était fortement déformée ou endommagée par des artefacts de préparation, l'image était exclue de la pile et l'image adjacente la mieux adaptée était dupliquée pour maintenir le volume de tissu. Les vaisseaux lymphatiques ont été suivis et marqués de manière rétrograde tandis que les vaisseaux sanguins ont été marqués en antérograde à partir des LH (Fig. iv supplémentaire).

Les échantillons ont été préfixés dans du glutaraldéhyde à 2,5 % pendant 2 h à 4 °C puis déminéralisés à l'aide de K-CX (Falma, Tokyo, Japon), lavés 3 fois dans du PBS pendant 10 min et postfixés dans 1 % d'OsO4 pendant 1 h. Le lavage au PBS a été répété deux fois pendant 15 minutes et l'échantillon a été déshydraté dans des concentrations croissantes d'éthanol puis transféré dans de l'acétone. Les échantillons ont été infiltrés puis noyés dans de la résine époxy. Des sections de balayage en série de 400 μm colorées au bleu de toluidine ont été préparées pour la microscopie optique et des sections de 80 nm coupées pour la microscopie électronique à transmission, puis visualisées à l'aide d'un microscope électronique JEM-1400Flash (JEOL, Tokyo, Japon).

Les analyses ont été effectuées à l'aide de SPSS 26 (IBM Corp. Released 2019. Armonk, NY) et SPSS 27 (IBM Corp. Released 2020. Armonk, NY). Tous les tests statistiques réalisés étaient des tests bilatéraux avec p < 0,05 considérés comme statistiquement significatifs.

Présenté à la 31e Conférence scientifique annuelle sur la chirurgie plastique de l'Université de Tokyo, janvier 2020, Tokyo, Japon.

Les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Cellules endothéliales des vaisseaux sanguins

Vert d'indocyanine

Lymphangiographie par fluoroscopie proche infrarouge

Cellule endothéliale lymphatique

Coeur lymphatique

Échographie ultra-haute fréquence

Troncs lymphatiques longitudinaux latéraux

Troncs lymphatiques longitudinaux paraabdominaux

Troncs lymphatiques longitudinaux parépigastriques

Troncs lymphatiques subvertébraux longitudinaux

Vaisseaux lymphatiques intra-osseux vertébraux transversaux

Veines intra-osseuses vertébrales transversales

veine cave postérieure

Latérale veineuse

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Ce travail a été financé par la Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (numéros de subventions : 21K09764 et 18H04061). Nous tenons à remercier sincèrement Mme Kiku Shinano pour le soutien administratif général offert et le Dr Jackson Chipaila, le professeur Taizo Shiraishi, le Dr Takahara Iino et Mme Miyuki Namikata pour leur aide dans les expériences.

Ce travail a été financé par la Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (numéros de subvention : 21K09764 et 18H04061).

Département de chirurgie plastique et reconstructive, École supérieure de médecine, Université de Mie, 2-174 Edobashi, Tsu, Préfecture de Mie, 514-8507, Japon

Chihena H. Banda, Makoto Shiraishi, Kohei Mitsui, Yoshimoto Okada, Kanako Danno, Ryohei Ishiura, Kaho Maemura et Mitsunaga Narushima

Faculté des sciences de la vie et de l'environnement, Université de Tsukuba, 1-1-1 Tennodai, Tsukuba, préfecture d'Ibaraki, 305-8571, Japon

Chikafumi Chiba

Département d'immunothérapie personnalisée contre le cancer, École supérieure de médecine, Université de Mie, 2-174 Edobashi, Tsu, Préfecture de Mie, 514-8507, Japon

Akira Mizoguchi

Département de pathologie et de biologie matricielle, École supérieure de médecine, Université de Mie, 2-174 Edobashi, Tsu, Préfecture de Mie, 514-8507, Japon

Kyoko Imanaka-Yoshida & Kazuaki Maruyama

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CHB, MS, MN, CC et Ko.M. conçu l'étude. CHB, MS, MN, YO, KD, RI, Kah.M. et CC a effectué l'acquisition des données. CHB, MS, MN, Ka.M et CC ont participé à l'analyse et à l'interprétation des données. CHB a rédigé le manuscrit et MS, RI, MN, YO, KD, Ko.M., Ka.M., KIY, AM, CC ont révisé le manuscrit. Tous les auteurs listés ont approuvé la version finale du manuscrit et ont accepté d'être personnellement responsables du contenu de cette étude.

Correspondance à Mitsunaga Narushima.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Banda, CH, Shiraishi, M., Mitsui, K. et al. Analyse structurale et fonctionnelle du système lymphatique du triton. Sci Rep 13, 6902 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34169-w

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Reçu : 19 décembre 2022

Accepté : 25 avril 2023

Publié: 27 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-34169-w

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