La plateforme VersaLive permet la culture microfluidique de cellules de mammifères pour des applications polyvalentes

Communications Biology volume 5, Article number: 1034 (2022) Citer cet article

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Une correction de l'auteur à cet article a été publiée le 13 octobre 2022

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La culture cellulaire basée sur la microfluidique permet une régulation spatio-temporelle précise du microenvironnement, l'imagerie des cellules vivantes et une meilleure récapitulation des conditions physiologiques, tout en minimisant la consommation de réactifs. Malgré leur utilité, la plupart des systèmes microfluidiques sont conçus avec une application spécifique à l'esprit et nécessitent généralement un équipement et une expertise spécialisés pour leur fonctionnement. Toutes ces exigences empêchent la culture cellulaire basée sur la microfluidique d'être largement adoptée. Ici, nous avons conçu et mis en œuvre une plate-forme microfluidique de culture cellulaire de perfusion polyvalente et facile à utiliser pour de multiples applications (VersaLive) ne nécessitant que des pipettes standard. Ici, nous présentons les multiples utilisations de VersaLive (par exemple, l'imagerie de cellules vivantes en accéléré, l'immunomarquage, la récupération cellulaire, la lyse cellulaire, la transfection plasmidique) dans les lignées cellulaires de mammifères et les cellules primaires. VersaLive pourrait remplacer les formats de culture cellulaire standard dans plusieurs applications, réduisant ainsi les coûts et augmentant la reproductibilité entre les laboratoires. La mise en page, la documentation et les protocoles sont open source et disponibles en ligne sur https://versalive.tigem.it/.

Les systèmes à micro-échelle peuvent être conçus pour répondre aux exigences expérimentales difficiles à satisfaire ou totalement impossibles dans la culture cellulaire standard de mammifères1,2,3. En général, l'utilisation de la microfluidique pour la culture cellulaire permet un contrôle précis des facteurs extrinsèques (par exemple, les nutriments, le traitement médicamenteux, le confinement des échantillons) tout en imitant mieux les conditions physiologiques4,5,6,7. Grâce aux volumes réduits, la microfluidique permet de minimiser la consommation de produits chimiques coûteux. Le degré plus élevé de contrôle sur les conditions expérimentales augmente la fiabilité des protocoles où le résultat est par ailleurs plus dépendant des compétences de l'opérateur. Au cours des dernières années, par exemple, l'utilisation de systèmes microfluidiques s'est révélée prometteuse pour faciliter un meilleur diagnostic du cancer en normalisant l'analyse des biomarqueurs immunohistochimiques8,9,10. D'autres applications clés récentes de la microfluidique dans les cellules de mammifères sont le séquençage unicellulaire à haut débit11,12, le criblage de médicaments parallélisé13, la modulation temporelle des traitements14 et le contrôle de rétroaction automatisé des processus biologiques15.

Les plates-formes microfluidiques sont généralement conçues pour des applications uniques spécifiques (par exemple, la culture cellulaire4, la transcriptomique unicellulaire11, l'immunomarquage de tissus fixes9) et impliquent la plupart du temps des processus de microfabrication multicouches complexes14,16,17. Kolnik et al. ont développé une plateforme microfluidique pour l'imagerie de cellules vivantes capable de stimuler dynamiquement des cellules cultivées avec deux entrées et tous leurs ratios mixtes14. Cette plate-forme nécessite une fabrication maître multicouche, utilise un protocole de chargement de cellule complexe, exige l'utilisation d'équipements supplémentaires (c'est-à-dire des moteurs pas à pas, des contrôleurs externes) et de longs tubes de connexion, imposant ainsi des volumes morts qui dépassent le volume réel de la puce très microfluidique. En revanche, Gagliano et al. ont exploité un dispositif microfluidique monocouche et autonome pour augmenter l'efficacité du processus de reprogrammation de la pluripotence des cellules somatiques humaines4. Cette plate-forme a l'avantage d'une géométrie et d'une fabrication simples mais avec l'inconvénient de la seule culture cellulaire statique qui limite les applications possibles. Tant Kolnik et al. et Gagliano et al. les plates-formes ne sont pas optimisées pour une récupération directe des cellules cultivées.

Dans ce travail, nous avons conçu et développé un dispositif microfluidique polyvalent, que nous avons nommé VersaLive, pour permettre l'application de plusieurs protocoles pour les cellules de mammifères adhérentes, notamment la culture cellulaire, l'immunocoloration, l'imagerie de cellules vivantes et la récupération de cellules à l'aide de pipettes de laboratoire standard. Pour faciliter l'adoption à grande échelle de VersaLive et faciliter le transfert de protocoles expérimentaux standard vers la microfluidique, nous avons conçu VersaLive pour qu'il soit répliqué via des procédures de microfabrication simples et que toutes les opérations sur puce puissent être effectuées par pipetage standard. Nous avons démontré la culture de lignées cellulaires et de cellules primaires et l'application d'une variété de protocoles allant de l'immunocoloration à la transfection plasmidique et à la lyse cellulaire.

Le dispositif est représenté sur la figure 1 ; il se compose d'un élastomère perméable aux gaz (polydiméthylsiloxane (PDMS)) fabriqué au moyen de la photolithographie standard et de la lithographie douce et collé sur une lamelle de verre de microscopie. Le dispositif est conçu de manière à ce qu'une seule étape photolithographique soit nécessaire pour préparer la plaquette, permettant ainsi une réplication rapide et facile de la technologie également dans des laboratoires sans expertise spécifique en microfabrication. La fabrication de puces PDMS ne nécessite pas d'alignement des couches et le processus de fabrication complet peut être appris par du personnel inexpérimenté en 1 journée de formation. Le matériel nécessaire pour préparer les puces VersaLive est détaillé dans le tableau supplémentaire 1. Comme le montre la figure 1a, la plate-forme se compose de cinq chambres de culture de 250 µm de large. Le choix du nombre de chambres à placer sur une puce a été dicté par les contraintes géométriques des réservoirs de 3 mm de large qui doivent être espacés dans une lamelle circulaire de 30 mm et permettre de découper à l'aide d'un poinçon de biopsie. Chaque chambre est reliée d'un côté à une voie principale commune et, de l'autre côté, à une voie d'entrée indépendante. Chaque canal d'entrée se compose de deux canaux parallèles de 150 μm de large pour augmenter la robustesse contre le colmatage par les particules de poussière. Les canaux sont accessibles via des ports (Fig. 1a) qui agissent comme des réservoirs où les intrants (par exemple, milieu de croissance, médicaments, réactifs) peuvent être échangés. Seule la pression hydrostatique entraîne le flux des orifices vers les chambres, supprimant ainsi les pompes, les moteurs ou les régulateurs de pression. Des filtres cellulaires sont intégrés sur un côté de chaque chambre de culture pour contenir les cellules dans la chambre pendant la phase de chargement en empêchant tout ce qui dépasse 5 µm de largeur de passer à travers le filtre. Une résistance fluidique de 20 µm de largeur et de 6 mm de longueur relie chaque chambre de culture à ses canaux d'entrée. La résistance fluidique appropriée a été trouvée en testant plusieurs longueurs de la même conception serpentine. La résistance a pour but de permettre le chargement des cellules dans les chambres en quelques secondes à partir du remplissage du réservoir tout en assurant, une fois les cellules adhérant à la lame de verre, l'absence de contrainte de cisaillement lors de la perfusion.

a Disposition du dispositif microfluidique avec cinq chambres indépendantes. D'un côté, toutes les chambres sont reliées au canal principal qui se développe du port A au port B des schémas. Les fluides peuvent être dirigés vers chaque chambre indépendamment par des ports dédiés (ports #1 à #5 sur les schémas). La résistance à l'écoulement en serpentin empêche les contraintes de cisaillement des cellules pendant les opérations de l'appareil. b, c Modes de fonctionnement de VersaLive et leurs simulations par éléments finis dans le logiciel COMSOL Multiphysics (encadré en pointillés). Dans le mode à entrée unique "perfusion" (b), le canal principal est exploité pour délivrer le même milieu à toutes les chambres en même temps. Le mode multi-entrées (c) exploite les ports dédiés pour fournir différentes entrées (c.-à-d. médias, produits chimiques) à chaque chambre en évitant les contaminations croisées. d Pendant le chargement des cellules, la suspension cellulaire s'écoule à travers le canal principal et dans les chambres. Une fois dans la chambre, les cellules ralentissent et sont finalement arrêtées par les caractéristiques du filtre comme prévu dans le profil de vitesse de la simulation. Barre d'échelle, 150 µm. e On a observé que l'évaporation du solvant au niveau des réservoirs augmentait la concentration en soluté du contenu du canal pendant la perfusion. L'effet a été complètement supprimé par l'ajout d'une couche d'huile minérale au niveau des réservoirs. Dans le graphique, un seul passage représentatif est rapporté.

Toutes les opérations dans VersaLive sont effectuées en pipetant simplement le contenu dans et hors des ports qui agissent effectivement comme des réservoirs. VersaLive peut être utilisé de deux manières : le mode à entrée unique, où la même entrée (par exemple, le milieu de croissance cellulaire) est délivrée à toutes les chambres cellulaires (Fig. 1b) ou le mode à entrées multiples, où une entrée différente peut être délivrée à chacune des 5 chambres (Fig. 1c). Le mode à entrée unique est mis en place en pipetant un volume allant jusqu'à 20 μL dans le réservoir connecté au canal principal (port A sur la Fig. 1b) tout en laissant tous les autres réservoirs vides. Nous appelons cette configuration le mode à entrée unique "perfusion", car un flux constant du réservoir rempli vers les chambres cellulaires sera présent. Une variante du mode à entrée unique est obtenue si tous les réservoirs sont remplis avec le même volume. Dans ce cas, aucun flux ne sera présent dans le dispositif, donnant lieu à une culture cellulaire statique. Ce mode de fonctionnement « statique » à entrée unique est particulièrement pratique lors de la phase d'adhésion des cellules, lorsque les cellules ne sont pas complètement fixées à la puce et qu'un flux risquerait de les déplacer.

Dans le cas du mode multi-entrées, tous les réservoirs d'entrée sont remplis tandis que les orifices du canal principal sont laissés vides (Fig. 1c). Cette configuration crée un flux actif à travers chaque chambre suffisamment fort pour empêcher le reflux du canal principal, mais suffisamment lent pour éviter les contraintes de cisaillement des cellules (Fig. 2a). Nous avons vérifié qu'un volume de 20 μL par chambre suffira pour au moins 24 h de perfusion constante dans un incubateur cellulaire. Le mode multi-entrées est applicable, par exemple, lorsque différentes concentrations d'une petite molécule ou d'un anticorps doivent être testées en parallèle, comme pour le criblage de médicaments ou l'immunocoloration.

a Les cellules CHO-K1 dans les chambres indiquées ont été exposées à un traitement à la tunicamycine (0,5 μg/mL pendant 20 h) et la réponse au stress intégrée a été mesurée par l'intensité de la fluorescence CHOP :: GFP. La troisième ligne montre la rhodamine B qui a été utilisée comme traceur de flux pour vérifier le bon flux dans la plate-forme tout au long de l'acquisition en accéléré. Barre d'échelle, 150 µm. b Évolution dans le temps de la fluorescence moyenne de CHO :: GFP dans les cellules des chambres n° 1, n° 2, n° 3, n° 4 (résolution temporelle de 15 min). c La quantification unicellulaire de la fluorescence CHO :: GFP des images rapportées dans a a renvoyé une différence de 15 fois entre les échantillons traités et non traités. Les points représentent des cellules individuelles (n = 38 dans #1, n = 28 dans #2, n = 49 dans #3, n = 55 dans #4, n = 24 dans #5) tandis que les barres noires sont des valeurs médianes.

Le logiciel COMSOL Multiphysics a été utilisé pour simuler chaque mode de fonctionnement (Méthodes), afin de calculer les profils de vitesse résultants lorsque des différences de pression hydrostatique réalistes sont appliquées sur la puce, comme indiqué dans les encarts en pointillés (Fig. 1b, c).

Indépendamment du mode de fonctionnement choisi, les cellules sont toujours chargées dans les chambres en utilisant le mode d'entrée unique "perfusion", comme illustré à la Fig. 1d. L'acquisition en accéléré de l'étape de chargement des cellules a été utilisée pour estimer la vitesse de chargement des cellules HeLa, qui s'est avérée être de 150 µm par seconde à l'entrée de la chambre ; il faut ensuite 5 secondes supplémentaires pour parcourir 150 µm avant de finalement s'arrêter contre le filtre, conformément au profil de vitesse obtenu dans les simulations et illustré sur les Fig. 1b, c. Bien que les cellules soient initialement ensemencées plus près des poteaux, elles forment ensuite une monocouche uniforme qui finit par recouvrir la surface de la chambre. Le nombre initial de cellules à charger dans les chambres peut varier selon le type de cellule et les exigences expérimentales (par exemple, la taille de la cellule, la durée de l'expérience, la couverture cellulaire, les horaires, la nécessité d'une monocouche, les caractéristiques de la lignée cellulaire). Le taux de chargement des cellules dans une chambre peut être facilement ajusté en faisant varier la concentration de la suspension cellulaire. Pour éviter l'adhérence des cellules aux régions de la puce autres que les chambres (par exemple, canal principal, réservoirs), il est préférable, cependant, d'ajuster la concentration cellulaire pour maintenir le temps de chargement court, c'est-à-dire en quelques minutes. Dans nos expériences, nous avons observé que pour effectuer le chargement d'une puce entière en quelques minutes, la concentration cellulaire optimale pour les cellules HeLa variait entre 1000 et 5000 cellules par microlitre.

Exposés à l'environnement extérieur, le petit volume des réservoirs a tendance à s'évaporer avec le temps même s'ils sont conservés dans un incubateur cellulaire, comme le montre la Fig. 1e. Cet effet peut cependant être éliminé en pipetant 2,5 μL d'huile minérale dans les réservoirs, comme le montre la Fig. 1e où une augmentation dans le temps de la concentration de soluté dans le réservoir a été observée en l'absence d'huile, mais complètement abolie en sa présence.

Nous avons validé la capacité de la plateforme microfluidique à fournir des intrants chimiques indépendants à chacune des cinq chambres de culture au moyen d'une lignée cellulaire CHO-K1 taguée CHOP :: GFP18. CHOP est un facteur de transcription dont l'expression est induite par l'activation de la voie Integrated Stress Response (ISR) et par le stress du réticulum endoplasmique (ER). Les cellules ont été chargées dans les chambres et conservées pendant la nuit dans un incubateur avec le mode d'entrée unique statique dans un milieu de croissance standard pour assurer l'adhérence des cellules à la surface du verre. Le lendemain, tous les réservoirs ont été vidés par pipetage et la puce a été commutée en mode de fonctionnement à entrées multiples en ajoutant du milieu frais aux réservoirs connectés aux chambres n° 2 et n° 4, tandis que la tunicamycine, dissoute dans du milieu frais (0,5 µg/mL), a été ajoutée aux chambres n° 1, n° 3 et n° 5, comme le montre la figure 2a. La tunicamycine est un puissant inducteur du stress du RE en bloquant la N-glycosylation des protéines et devrait donc induire l'expression de CHOP :: GFP dans les cellules rapporteurs. La puce VersaLive a ensuite été placée sur un microscope à fluorescence inversé et chaque chambre a été imagée pendant 20 h à 15 min d'intervalle. Comme le montre la Fig. 2a – c, à la fin du traitement, seules les cellules exposées à la tunicamycine exprimaient CHOP :: GFP, confirmant l'absence de flux croisés entre les chambres. De plus, comme vérification supplémentaire du bon fonctionnement de l'appareil et de l'absence de flux croisés, nous avons ajouté de la rhodamine B au réservoir d'entrée de la chambre #3. Ce colorant fluorescent rouge n'a aucun effet toxique sur les cellules. Comme prévu, la fluorescence rouge a été détectée uniquement à la sortie de la chambre #3 mais était absente dans les quatre autres chambres. L'expression de CHOP :: GFP au fil du temps est rapportée à la Fig. 2b et montre une expression sensiblement plus élevée dans les échantillons traités déjà après 8 h d'exposition à la tunicamycine. Pour quantifier la différence de stress ER entre les chambres, le dernier moment du traitement a été analysé avec une résolution de cellule unique. L'exposition à la tunicamycine pendant 20 h a entraîné une multiplication par 15 de l'expression de CHOP :: GFP (Fig. 2c).

Les modes de fonctionnement à entrée unique et à entrées multiples peuvent être exploités pour mettre en œuvre n'importe quel protocole d'intérêt tel que la livraison d'agents de fixation (par exemple, le paraformaldéhyde) et d'anticorps marqués directement aux cellules. Les étapes de lavage et de coloration des protocoles d'immunocoloration établis peuvent être reproduites avec l'avantage d'une consommation efficace de réactif inférieure à un microlitre, le gain de signal dû à la perfusion et la durée du protocole réduite de quelques heures à quelques minutes. Pour mettre en évidence cette possibilité, nous avons effectué une immunocoloration du récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (HER2) dans deux lignées cellulaires de cancer du sein (AU565 et HCC38 comme contrôle négatif). HER2 est une protéine membranaire et est surexprimée dans certaines formes de cancer du sein, et c'est un biomarqueur cliniquement pertinent pour le diagnostic du cancer du sein. Les cellules cancéreuses exprimant HER2 (HER2+) sont plus prolifératives mais entraînent un meilleur pronostic tandis que celles n'exprimant pas HER2 (HER2−) sont plus résistantes à la chimiothérapie cytotoxique19. Pour cette raison, la discrimination entre ces deux types de tumeurs est importante pour décider de la stratégie thérapeutique qui sera menée. Ici, les lignées cellulaires de cancer du sein HER2+ (AU565) et HER2− (HCC38) ont été utilisées pour valider le protocole d'immunofluorescence dans VersaLive. Les deux types de cellules ont été cultivées sur deux puces VersaLive différentes, fixées chimiquement et marquées par fluorescence via une immunocoloration anti-HER2 directement sur le dispositif. Comme le montrent les figures 3a, b, l'immunomarquage sur puce était spécifique au type de cellule et a entraîné la localisation correcte de la membrane du récepteur HER2. Suite à une analyse quantitative, il est possible d'apprécier que la coloration pendant 10 min sur VersaLive a entraîné une intensité 12 fois plus élevée par rapport à la méthode traditionnelle sur lame. Fait intéressant, seule une petite différence d'intensité est appréciable lorsque les lames sont incubées pendant 1 h au lieu de 10 min. Nous associons cette augmentation de l'intensité du signal et de la qualité de l'image à la perfusion, qui permet l'accumulation d'anticorps marqués - donc de signal - au fil du temps. Cette accumulation n'est pas possible dans les protocoles traditionnels.

a, b Immunofluorescence sur puce du récepteur membranaire HER2 sur les cellules AU565 (a, contrôle positif) et les cellules HCC38 (b, contrôle négatif). Barre d'échelle, 150 µm. c Comparaison des intensités de signal IF pour la coloration par immunofluorescence sur VersaLive et sur lame en utilisant un protocole standard. Par rapport aux protocoles de diapositives standard, IF sur VersaLive a entraîné une multiplication par 10 du signal tout en raccourcissant le temps de traitement et en diminuant la consommation de réactifs. Les barres noires représentent les valeurs médianes des ROI uniques (points gris, n = 8). d, e Culture de cellules primaires d'épithélium pigmenté de rétine de souris (RPE). Fixation chimique et immunomarquage sur puce, marquage de la citrate synthase (vert), de la f-actine (rouge) et des noyaux cellulaires (bleu). Les cellules RPE ont pu adhérer à la puce tout en conservant leur pigment foncé caractéristique. Barre d'échelle, 30 µm. f Transfection plasmidique sur puce de cellules HeLa, chambre n°1 à chambre n°5 (ch#n) de la même puce. Efficacité de transfection de 25,3 ± 8,8 % (moyenne ± écart-type, n = 5). Barre d'échelle, 150 μm.

La culture de cellules primaires de patients est d'une grande importance pour le diagnostic de maladies ou à des fins de recherche, pour étudier des cellules primaires à partir de modèles animaux. VersaLive peut être un outil puissant pour manipuler et cultiver des cellules primaires. À titre d'exemple, nous avons cultivé des cellules primaires collectées à partir des cellules de l'épithélium pigmentaire de la rétine de souris (RPE) pour démontrer la possibilité de cultiver des cellules primaires dans VersaLive. Les cellules RPE récupérées à partir de tissus frais ont pu adhérer à la surface en verre de la puce et se développer tout en conservant leur pigment foncé caractéristique (Fig. 3d, e).

Nous tenons à souligner que VersaLive, cependant, n'est pas adapté à la capture de cellules rares. Dans ce but, différents systèmes microfluidiques ont été développés pour isoler et concentrer des types spécifiques de cellules à partir d'un échantillon global en fonction, par exemple, de leur phénotype20.

La transfection liposomale est une méthode chimique bien établie pour délivrer des gènes dans les cellules. L'intérêt pour les produits de l'expression de ces gènes peut aller des sciences fondamentales aux sciences médicales ou pour des applications industrielles21. La microfluidique s'est avérée être un outil utile pour augmenter le rendement des cellules transfectées tout en minimisant la consommation de réactifs22. Cependant, les travaux antérieurs exploitant les avantages de la perfusion nécessitaient encore des systèmes de tuyauterie et de pompage externes pour entraîner les produits chimiques dans les puces22,23. La nécessité de matériel supplémentaire augmente le coût par expérience et l'utilisation de tubes ajoute inévitablement un volume mort, ce qui signifie qu'une fraction des réactifs utilisés ne sera pas utilisée pour la transfection réelle mais perdue dans le processus. VersaLive n'a pas de volume mort car il ne nécessite pas de tubulure ou de système de pompage externe. En fait, quelle que soit la quantité de mélange de transfection qui reste dans les réservoirs à la fin de l'étape de perfusion, elle peut être récupérée pour une autre transfection sur puce.

Nous avons mis en œuvre un protocole pour la transfection de plasmide d'ADN sur puce dans VersaLive en adaptant la transfection de réactifs à base de lipides dans des plaques à 96 puits pour travailler sur puce. A partir d'un criblage en plaque de 96 puits, nous avons déterminé le mélange de transfection le plus approprié des concentrations d'ADN et de complexes lipidiques. Il a été trouvé que la combinaison optimale était de 300 ng d'ADN et 0,5 μL de réactif de transfection (Méthodes). Pour la transfection sur puce, l'ADN et les lipides ont été dilués avec du milieu de croissance cellulaire jusqu'à un volume final de 50 μL. Des aliquotes de ce mélange stock de transfection ont été utilisées pour perfuser les cellules pendant 2 h en mode multi-entrées avec une consommation effective de réactif de l'ordre de quelques microlitres par chambre. Sur la figure 3f, nous montrons le résultat de la transfection de cellules avec un plasmide exprimant un rapporteur fluorescent mCherry en aval d'un promoteur CMV obtenant une efficacité de transfection de 25, 3% ± 8, 8 par chambre. Nous avons ensuite comparé l'efficacité de transfection entre VersaLive et la plaque standard à 96 puits en utilisant le même protocole de transfection inverse. L'efficacité de transfection mesurée en plaque 96 puits (27,2 ± 4,6%) et donc comparable à VersaLive.

Le revêtement de la surface avant l'ensemencement cellulaire est bénéfique ou, pour certains types de cellules, nécessaire (par exemple, cultures sans sérum). VersaLive est entièrement compatible avec toute solution de revêtement à faible viscosité (par exemple, poly-L-lysine, vitronectine, fibronectine). À titre d'exemple de culture cellulaire dans VersaLive avec revêtement, nous avons effectué une imagerie cellulaire vivante de la tubulation d'endosomes chargés de transferrine dans des cellules HK2 dans des puces VersaLive recouvertes d'une solution de vitronectine dans du PBS (film supplémentaire 1).

Selon les lignées cellulaires étudiées, la contrainte de cisaillement peut être un paramètre à minimiser ou à exploiter lors de la culture sous flux. Dans toutes les expériences présentées dans ce travail, l'intérêt était de minimiser la contrainte de cisaillement sur les cellules, donc toutes les pressions utilisées dans les protocoles répondent à cette exigence. Cependant, VersaLive convient également aux études où la contrainte de cisaillement est une condition préalable. En plaçant des réservoirs externes à différentes hauteurs, il est possible de réguler facilement la pression du débit appliqué. Par exemple, en plaçant les réservoirs à 10 cm au-dessus de la puce, il a été possible d'appliquer un flux de 10 mbar sur les cellules HeLa, ce qui a provoqué le lessivage des cellules de la chambre de culture (Supplémentaire Film 2).

VersaLive permet un accès direct aux cellules en retirant complètement le PDMS de la lame de verre où il est collé de manière réversible (Fig. 1a, b supplémentaires). Nous envisageons que cette fonctionnalité soit utile pour le re-placage cellulaire, le séquençage cellulaire et toutes les applications qui nécessitent une récupération complète de l'échantillon. Pour démontrer que l'opération d'élimination du PDMS n'endommage pas les cellules, le même champ de vision a été acquis en imagerie en direct et pour l'échantillon fixé chimiquement, après l'élimination du PDMS (Fig. 1c, d supplémentaires). De plus, VersaLive peut être utilisé pour récupérer le contenu de la chambre de manière sélective et précise. Dans les Fig. 2a à f supplémentaires, nous avons rapporté la séquence d'opérations dans VersaLive pour lyser sélectivement le contenu de chaque chambre à partir de la chambre n ° 1 à la chambre n ° 5. En utilisant le protocole décrit, il est possible de collecter les lysats de chambre dans des ports séparés, supprimant tout risque de contamination croisée. En vidant un réservoir à la fois ou tous à la fois, ce même protocole est adapté à une récupération de contenu séquentielle ou parallèle.

Les opérations rapportées dans les Fig. 2a à f supplémentaires sont effectuées à l'aide de solutions colorées pour mettre en évidence les voies d'écoulement. Pour démontrer le bon fonctionnement de ce protocole, l'ARN des cellules de chaque chambre a été collecté, une bibliothèque de séquençage a été préparée et sa qualité analysée par l'instrument TapeStation pour déterminer sa distribution de taille (Fig. 2g supplémentaire). Les données montrent que l'ARN a été récupéré avec succès dans toutes les chambres, malgré certaines différences dans la quantité d'ARN extrait.

VersaLive offre une plate-forme microfluidique facile à adopter pour les cellules de mammifères, elle permet de choisir entre la perfusion et la culture cellulaire statique sans nécessiter de composants externes pour fonctionner. VersaLive permet également un accès direct aux cellules cultivées avec l'avantage de réduire la consommation de réactifs et de vaisselle en plastique. Des protocoles supplémentaires peuvent être facilement adaptés à VersaLive en redimensionnant les concentrations utilisées dans le système de culture macroscopique, avec l'avantage supplémentaire de réduire les coûts et d'accélérer les réactions.

Par rapport à la culture cellulaire sur plaque multipuits, VersaLive présente plusieurs avantages, mais également certaines limites qui sont schématiquement résumées dans le tableau 1. VersaLive diminue la consommation de réactifs ainsi que de vaisselle en plastique de laboratoire par rapport à la culture cellulaire sur plaque multipuits. Globalement, cela se traduit par une diminution du coût par expérience. De plus, VersaLive donne à l'utilisateur la possibilité de décider de procéder à une culture cellulaire statique traditionnelle, similaire aux plaques multi-puits, ou de mettre en œuvre une culture cellulaire en perfusion, comme pour les configurations commerciales plus coûteuses et encombrantes. La mise en œuvre de la culture cellulaire statique dans VersaLive, ou dans les systèmes microfluidiques en général, imite mieux les conditions physiologiques de la croissance cellulaire en raison des volumes réduits, même par rapport aux formats multi-puits (par exemple, augmentation de la concentration des facteurs sécrétés, contraintes géométriques optimisées), avantages qui ne sont pas réalisables dans la culture cellulaire sur plaque multi-puits. La culture cellulaire en perfusion présente un ensemble d'avantages par rapport aux méthodes de culture statique, telles que la mise en œuvre d'un flux continu de nutriments pour éviter l'épuisement au fil du temps ; maintenir une concentration constante d'un médicament ou d'une petite molécule au fil du temps ; et accélérer les protocoles standards.

Certaines des limitations actuelles de VersaLive sont son faible débit avec jusqu'à cinq chambres par puce, qui pourraient cependant être mises à l'échelle en utilisant la même topologie mais en augmentant la longueur du canal principal et donc le nombre de chambres qui y sont connectées. De plus, la capacité de rétention des filtres cellulaires n'est efficace que pour les cellules de diamètre supérieur à 5 μm, alors que la durée maximale de l'expérience sans l'intervention d'un opérateur est d'environ 24 h. Cependant, il est possible de prolonger la durée d'une expérience en utilisant des pointes de pipette attachées aux réservoirs pour augmenter la capacité volumique. Malgré ces limitations, nous pensons que VersaLive fournit un point d'entrée unique à faible barrière pour les laboratoires intéressés par l'adoption de la microfluidique dans leurs activités de culture de cellules de mammifères. En effet, bien qu'il existe de nombreux dispositifs microfluidiques qui peuvent être utilisés pour effectuer les protocoles uniques décrits ici, à notre connaissance, aucun de ces dispositifs n'a été conçu pour des applications polyvalentes à base de pipette. En tant que tel, VersaLive offre un avantage unique aux chercheurs qui souhaitent bénéficier des avantages de la culture cellulaire microfluidique mais qui ont été rebutés par la complexité, le coût de l'équipement nécessaire et l'expertise requise. Nous pensons que VersaLive peut aider à "démocratiser" la microfluidique pour les cellules de mammifères, contribuant ainsi à augmenter la réplicabilité expérimentale tout en minimisant l'utilisation de réactifs.

La technologie VersaLive est open-source et tous les protocoles et matériaux sont disponibles en ligne (https://versalive.tigem.it/).

La plateforme microfluidique VersaLive a été conçue à l'aide d'Autodesk Fusion 360. Le profil de vitesse de la puce a été modélisé à l'aide de la méthode des éléments finis (COMSOL Multiphysics 5.4). Dans les modes d'utilisation simulés (Fig. 2), une pression de 0,5 mbar a été appliquée à chaque entrée tandis que les sorties étaient réglées à une pression nulle. Cette valeur de pression a été choisie car équivalente aux 5 mm de pression hydrostatique lorsque les réservoirs sont remplis au maximum de leur capacité volumique. La direction de l'écoulement dans les parcelles de simulation a été indiquée à l'aide de flèches dont les dimensions reflètent l'amplitude de la vitesse sur une échelle logarithmique. Un modèle CAO 2D de la puce a été exporté dans Autodesk AutoCAD 2020 pour concevoir le masque de photolithographie imprimable.

Les puces microfluidiques ont été fabriquées en utilisant une combinaison de procédures standard de photolithographie et de lithographie douce24. Le moule maître a été microfabriqué par photolithographie au masque de photorésist négatif SU-8 (SU-8 3035, Kayaku Advanced Materials Inc.) sur un substrat de plaquette de silicium. La résine photosensible a été enduite par centrifugation pour atteindre une épaisseur finale de 25 µm et traitée selon les directives du fabricant. La hauteur de la caractéristique a été confirmée par la mesure par microscopie optique de la section transversale d'une réplique en silicone des canaux. Avant la première utilisation du master, la passivation de sa surface est nécessaire pour faciliter l'étape de démoulage lors de la lithographie douce. Le maître a été passivé par dépôt en phase vapeur de perfluorosilane (1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-trichlorosilane, Merck kGaA). Plus précisément, le maître a été placé dans un dessiccateur avec un petit flacon contenant 20 µL de perfluorosilane. Le vide a ensuite été appliqué pendant une nuit pour permettre au perfluorosilane de s'évaporer et de réagir avec la surface de la plaquette de silicium, formant un revêtement super-hydrophobe lié par covalence. Le maître passivé a ensuite été utilisé comme moule pour la partie lithographie douce du processus de fabrication du dispositif microfluidique. La plateforme microfluidique VersaLive est formée d'un élastomère de silicone (PDMS) collé à une lame de verre. La base élastomère du PDMS a été soigneusement mélangée avec l'agent de durcissement dans un rapport de 10: 1, comme indiqué par la fiche technique du fabricant (Sylgard 184, Dow Corning). Les bulles d'air ont été éliminées du polymère non durci en appliquant un vide au mélange pendant 2 h ou jusqu'à ce qu'aucune bulle ne soit visible. Le mélange a ensuite été coulé sur le moule maître sur une épaisseur finale d'environ 5 mm. Si nécessaire, le vide a été appliqué une seconde fois pour éliminer les bulles formées lors de l'étape de coulée. Le moule avec le PDMS non durci a ensuite été placé dans un four à 80 ° C pendant au moins 2 h pour accélérer la réticulation du mélange de polymères. Une fois durci, le PDMS a été décollé du moule maître. La dalle PDMS a ensuite été placée avec les caractéristiques du motif vers le haut pour découper les puces individuelles. De même, les orifices d'accès ont été ouverts à l'aide d'un punch à biopsie de 3 mm (réf. 504649, World Precision Instruments). Les canaux des puces PDMS ont été scellés par collage au plasma des puces sur une lame de couverture en verre ronde (30 mm de diamètre, épaisseur n ° 1, Marienfeld). Les lames de verre et les puces PDMS ont d'abord été nettoyées des particules de poussière à l'aide de ruban adhésif. Pour l'activation de surface des lames de verre et des puces PDMS, un plasma d'air de 85 W à 0,4 mbar ou moins (ZEPTO version B, Diener electronic GmbH & Co. KG) a été utilisé. Pour les liaisons permanentes ou réversibles, 30 ou 10 secondes de plasma d'air ont été utilisées, respectivement. La puce a ensuite été placée dans un tube à lentille en aluminium (SM30L05, ThorLabs) utilisé comme support de puce. Le tube de lentille a permis le transfert en toute sécurité de la puce pendant le flux de travail expérimental (par exemple, établi, incubateur, microscope). Pour permettre une procédure d'acquisition d'image simple et fiable, le microscope Nikon a été équipé d'un support personnalisé pour les tubes de lentille en acrylique découpé au laser de 2 mm.

HeLa WT, ainsi que les lignées cellulaires de cancer du sein AU565 et HCC38 ont été achetées auprès de l'ATCC et cultivées dans un milieu cellulaire RPMI 1640 (sans L-glutamine, EuroClone). Des cellules rapporteurs CHO-K1 (aimable cadeau du professeur David Ron) 18 ont été cultivées dans du milieu cellulaire F-12 (Gibco). Les deux milieux cellulaires ont été complétés avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS, EuroClone), 1 % de L-glutamine (EuroClone) et 1 % de pénicilline-streptomycine (EuroClone).

La lignée cellulaire épithéliale du tubule proximal humain (HK2) a été achetée auprès de l'ATCC (#CRL-2190). Les cellules HK2 ont été cultivées dans du Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F12, Gibco) additionné de 5 % de FBS, 2 mM de L-glutamine, 1 U/ml d'antibiotiques (pénicilline/streptomycine) et 1 % d'insuline-transferrine-sélénium (ITS-Sigma Aldrich).

Les cellules ont été maintenues dans un incubateur à 37°C, 100% d'humidité et 5% de CO2. Avant le chargement d'un dispositif microfluidique, le contenu d'un flacon T25 à 90% de confluence a été collecté selon la procédure suivante. Tout d'abord, le milieu cellulaire utilisé a été retiré et les cellules ont été rincées avec 2 ml de solution saline tamponnée au phosphate sans calcium ni magnésium (PBS, EuroClone). Pour détacher les cellules du flacon, 0,5 ml de trypsine-EDTA à 0,05 % (Gibco) ont été ajoutés et le flacon a été replacé dans l'incubateur pendant deux minutes. Pour désactiver la trypsine, 2 ml de milieu cellulaire ont été ajoutés au flacon et les cellules ont été soigneusement mélangées jusqu'à ce que tous les agrégats visibles soient réduits. La suspension cellulaire résultante a été directement utilisée pour le chargement sur la puce. L'épithélium pigmentaire de la rétine de souris primaire (RPE) était un cadeau de Sabrina Carrella, PhD (TIGEM) et a été obtenu comme décrit précédemment25.

Le traitement plasma utilisé pour le collage PDMS-verre confère également une hydrophilie temporaire à la surface des canaux24,26. Une surface de canal hydrophile est essentielle pour permettre à toute solution à base d'eau de s'écouler dans les microcanaux (c'est-à-dire, le mouillage). Pour optimiser le flux de travail de fabrication d'un lot de puces, le processus de mouillage a été effectué quelques minutes après la procédure de collage. Pour le mouillage des canaux microfluidiques, 10 µL de PBS ont été ajoutés dans le port B de la puce jusqu'à ce que tous les canaux soient remplis. Si nécessaire, tous les ports ont été remplis de 10 µL de PBS et la puce a été placée dans un dessiccateur et le vide a été appliqué pendant 15 min ou jusqu'à ce que toutes les bulles d'air aient disparu. Pour un stockage à long terme (4 à 6 semaines), tous les réservoirs de la puce ont été remplis de 20 µL de PBS, le côté PDMS des puces a été scellé avec du ruban adhésif de bureau (Scotch Magic Tape, 3 M) et les puces ont été conservées à + 4 ° C jusqu'à utilisation.

Pour le chargement des cellules, le PBS utilisé pour le mouillage des canaux est retiré de tous les réservoirs et 10 µL de suspension cellulaire (1–5 × 106 cellules/mL) sont ajoutés au port B de l'appareil. Lors du remplissage du réservoir, les cellules commencent immédiatement à s'écouler à travers le canal principal et à entrer dans les chambres (Fig. 2b). Lorsqu'une chambre donnée est remplie avec le nombre approprié de cellules, 10 µL de milieu cellulaire sont ajoutés au port respectif pour diminuer le débit à travers cette chambre. Lorsque toutes les chambres sont remplies de cellules, 20 µL de milieu cellulaire sont ajoutés au port A et le port B est vidé pour laver le canal principal des cellules indésirables. Le port B est ensuite rincé des cellules résiduelles et rempli de 20 µL de milieu cellulaire. Ensuite, tous les ports d'entrée de #1 à #5 sont remplis jusqu'à un volume final de 20 µL de milieu cellulaire frais. Un volume égal de milieu cellulaire dans tous les ports empêche la formation de chutes de pression à travers la puce et permet la culture cellulaire statique. Au final, 2,5 µL d'huile minérale pour culture cellulaire (M8410, Merck kGaA) sont ajoutés à chaque réservoir pour éviter l'évaporation de leur contenu. Les puces sont restées dans l'incubateur pendant une nuit à 37 °C, 100 % d'humidité et 5 % d'atmosphère de CO2 avant le début des expériences. Les résultats des opérations de mouillage et de chargement des cellules ont été vérifiés à l'aide d'un stéréomicroscope inversé (Leica Microsystems).

Les acquisitions en accéléré de cellules CHO-K1 ont été acquises via un microscope Nikon Ti Eclipse équipé d'une lampe à mercure (Intensilight, Nikon), d'un appareil photo numérique EMCCD (iXon Ultra 897, Andor Technology Ltd) et d'une chambre d'incubation (H201-OP R2, Okolab). Avant le montage de la puce, l'incubateur a été équilibré à une température de 37 °C et 5 % d'air humidifié au CO2. Des acquisitions accélérées jusqu'à 20 h ont été acquises à l'aide d'un objectif à air ×40 (CFI Plan Fluor DLL ×40, 0,75 NA, Nikon Instruments) pour collecter le signal le plus élevé possible. Cependant, en raison de la position décentrée de la chambre n ° 5 dans ce dispositif spécifique, l'acquisition de cette chambre avec cet objectif n'était pas réalisable dans notre microscope. Pour l'analyse unicellulaire, la fluorescence des cellules de toutes les chambres a été acquise à la fin du traitement de 20 h à l'aide d'un objectif à air × 20 (CFI Plan Fluor DLL × 20, 0, 5 NA, Nikon Instruments). Selon l'expérience, des images ont été recueillies en contraste de phase (PC) et en épifluorescence pour les longueurs d'onde vertes, rouges et jaunes en utilisant les temps d'exposition et les ensembles de filtres respectivement indiqués dans le tableau 2.

Après un ensemencement d'une nuit, les puces VersaLive contenant des cellules CHO-K1 en culture statique ont été retirées de l'incubateur. A chaque puce, les réservoirs A et B ont été vidés. Ensuite, le contenu des réservoirs #2 et #4 a été renouvelé avec 15 µL de milieu cellulaire F12 frais. Ensuite, le contenu des réservoirs #1, #3 et #5 a été remplacé par 15 µL de tunicamycine 0,5 µg/mL dans du milieu cellulaire F12. Ensuite, 1 µL de sulforhodamine B 0,1 mg/mL (Merck kGaA) a été ajouté au réservoir #3 comme traceur de débit. A tous les réservoirs remplis (#1 à #5), 2,5 µL d'huile minérale pour culture cellulaire ont été ajoutés pour éviter leur évaporation. Les réservoirs A et B sont restés vides. La puce a ensuite été montée sur le microscope pour l'imagerie des cellules vivantes pour une acquisition time lapse de 20 h à des intervalles de 15 min entre chaque acquisition.

Pour quantifier la réponse au stress des cellules CHO-K1 traitées et non traitées avec de la tunicamycine, des images de microscopie de cellules vivantes ont été analysées à l'aide du plugin Trainable WEKA Segmentation27 dans le logiciel ImageJ. En bref, le logiciel a été entraîné à distinguer les cellules CHO dans les chambres de culture de VersaLive. La carte de probabilité renvoyée par le logiciel a été seuillée pour être convertie en un masque segmenté. Le masque a ensuite été superposé à l'image originale. Les intensités moyennes des cellules individuelles résultantes ont été utilisées pour quantifier leur réponse au stress.

Les lignées cellulaires de cancer du sein AU565 et HCC38 ont été chargées sur des puces VersaLive et cultivées pendant la nuit en culture cellulaire statique, comme décrit dans une section précédente de ce travail. Pour la fixation chimique sur puce, après élimination du milieu cellulaire, tous les ports ont été lavés avec 20 μL de PBS. Les cellules ont été perfusées en mode multi-entrées avec du paraformaldéhyde (PFA, 4 % p/v dans du PBS) pendant 10 min. Ensuite, tous les ports ont été lavés deux fois avec 20 μL de PBS suivis de 5 min de perfusion de PBS en mode multi-entrée. Pour éteindre la fluorescence du PFA, une solution de blocage (50 mM NH4Cl ; 0,5 % BSA dans du PBS) a été perfusée en mode multi-entrées pendant 30 min. Finalement, tous les ports ont été lavés avec 20 μL de PBS. Pour l'immunomarquage sur puce, un anticorps anti-HER2 (BB700 Mouse Anti-Human Her2/Neu, BD OptiBuild) dilué au 1/100 dans du tampon de blocage a été perfusé en multi-entrée pendant un temps défini par l'expérience (10 ou 30 min). Ensuite, tous les ports ont été lavés deux fois avec 20 μL de PBS. Pour préserver l'échantillon, tous les ports ont été remplis avec 20 μL de PBS et 2,5 μL d'huile minérale pour la culture cellulaire afin d'éviter l'évaporation. Les échantillons ont été conservés à 4 °C.

Les lignées cellulaires de cancer du sein AU565 (ERBB2+, contrôle positif) et HCC38 (ERBB2−, contrôle négatif) ont été ensemencées à 60–70 % de confluence sur des lamelles en verre (EXACTA-OPTECH, surface 10 × 10 mm2, épaisseur 0,13–0,16 mm) dans une plaque à 24 puits.

Après un lavage au PBS 1X, les cellules ont été fixées avec du PFA 4% pendant 10 min, puis lavées avec du PBS 1X. Après fixation, les cellules ont ensuite été bloquées avec du tampon de blocage, préparé avec du BSA 0,5 % (Sigma-Aldrich) et du NH4Cl 50 mM (Sigma-Aldrich) dans du PBS 1X, pendant 1 h à température ambiante (TA). Les cellules ont été incubées dans un environnement humidifié à température ambiante dans l'obscurité avec un anticorps primaire 1: 100 (anticorps anti-ERBB2 de souris conjugué à BB700, BD Bioscience). Le temps d'incubation a été fixé selon le plan expérimental. L'anticorps primaire a été préparé dans un tampon de blocage.

Après incubation des anticorps, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS 1X et une fois de plus avec ddH2O. Ensuite, des lamelles ont été montées dans Fluoroshield™ avec DAPI (Sigma-Aldrich) et des images de fluorescence ont été acquises à l'aide d'un microscope Nikon Ti Eclipse équipé d'une lampe à mercure (Intensilight, Nikon), d'un appareil photo numérique EMCCD (iXon Ultra 897, Andor Technology Ltd) et d'un objectif à air ×20 (CFI Plan Fluor DLL ×20, 0,5 NA, Nikon Instruments).

Les cellules RPE primaires de souris ont été chargées sur des puces VersaLive et laissées adhérer à la surface de la puce microfluidique pendant la nuit dans une culture cellulaire statique, comme décrit dans une section précédente de ce travail. La fixation chimique sur puce a été réalisée comme décrit précédemment pour les lignées cellulaires cancéreuses. L'immunocoloration sur puce a été initiée en perfusant pendant 10 min le tampon de perméabilisation (0,3% Triton X-100, 5% FBS dans PBS) en mode multi-entrées. Ensuite, l'anticorps primaire anti-citrate synthase (ab96600, Abcam) dans un tampon de blocage (0,5 % BSA, 0,05 % saponine, 50 mM NH4Cl, 0,02 % NaN3 dans du PBS) a été perfusé en mode multi-entrées pendant 10 min. Tous les ports ont ensuite été lavés avec 20 μL de PBS. Successivement, des ânes anti-lapin Alexa Fluor 488 (A-21206, Thermo-Fisher Scientific), Alexa Fluor 568 phalloïdine (A-12380, Thermo Fisher Scientific) et DAPI (D1306, Thermo Fisher Scientific) marqués par fluorescence ont été perfusés pendant 10 min en mode multi-entrée pour colorer les mitochondries, la f-actine et les noyaux, respectivement. Tous les ports ont ensuite été lavés deux fois avec 20 μL de PBS. Pour préserver l'échantillon, tous les ports ont été remplis avec 20 μL de PBS et 2,5 μL d'huile minérale pour la culture cellulaire afin d'éviter l'évaporation. Les échantillons ont été conservés à 4 °C.

Les cellules RPE primaires de souris ont été imagées par microscopie confocale (LSM 700, microscopie ZEISS) équipée de lasers 405, 488, 555 nm et d'un objectif à huile × 40 (EC Plan-Neofluar × 40 / 1,30 Oil DIC). Pour l'acquisition, des filtres DAPI (bleu), FITC (vert) et Texas Red (rouge) ont été utilisés.

Les puces VersaLive ont été recouvertes de vitronectine recombinante humaine tronquée (5 μg/mL dans du PBS 1 ×) en utilisant la puce en mode multi-entrées pendant 30 min à température ambiante avant le chargement des cellules. Après le chargement des cellules sur la puce, les cellules ont été laissées adhérer pendant une nuit dans un incubateur (37°C, 5% CO2). Au moment de l'expérience, les cellules HK2 ont été perfusées en mode multi-entrées à 37 ° C pendant 30 min avec un milieu sans sérum avec 50 μg / mL de transferrine conjuguée à Alexa Fluor 488 (T13342, Thermo Fisher Scientific) pour permettre l'endocytose et le chargement des endosomes de recyclage. Ensuite, le milieu a été changé et un milieu sans sérum avec 50 μg/mL de transferrine non marquée a été ajouté pour permettre le recyclage de la transferrine conjuguée à Alexa Fluor 488 qui a été évaluée par imagerie en direct à l'aide d'un microscope Nikon Ti équipé d'un module de disque rotatif et d'un objectif d'huile ×100 1,5 NA.

Pour la transfection sur puce, les cellules HeLa ont été chargées un jour avant la transfection en suivant la procédure déjà décrite. Le mélange de transfection (réactif de transfection Lipofectamine™ 3000, ThermoFisher Scientific) a été préparé conformément aux directives du fabricant et optimisé pour les volumes VersaLive. Le mélange contenait 300 ng d'ADN, 0,5 μL de réactif Lipofectamine, 0,6 μL de réactif P3000 et 10 μL de milieu Opti-MEM. Ce mélange a ensuite été dilué dans du milieu de croissance complet jusqu'à un volume final de 50 μL. Les cellules ont été perfusées via un mode multi-entrées dans un incubateur de cellules pendant 2 h en ajoutant 5 μL de mélange de transfection dilué dans chaque port de chambre et de l'huile minérale pour empêcher leur évaporation. Après transfection, le mélange a été remplacé par du milieu de croissance complet et la puce a été laissée en mode statique à entrée unique dans un incubateur cellulaire pendant 24 h. Ensuite, les images ont été acquises à l'aide du microscope Nikon Ti Eclipse.

Les cellules Hela ont été transfectées de manière inverse avec pCMV-NLS-mcherry-ccp3 obtenu à partir du clonage Golden Gate (boîte à outils EMMA) et un vecteur vide à l'aide de Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific) conformément aux instructions du fabricant. Vingt-quatre heures après la transfection, les cellules ont été récoltées pour mesurer la fluorescence via une analyse de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS).

L'effet de l'évaporation au niveau des réservoirs d'entrée a été évalué en exécutant deux dispositifs microfluidiques différents en mode multi-entrées. Les réservoirs d'entrée #1, #2, #4 et #5 ont été remplis avec 25 µL d'eau DI ; le réservoir d'entrée #3 était rempli de 25 µL de rhodamine B (0,1 mg/mL). Pour l'un des deux dispositifs, 2,5 µL d'huile minérale pour culture cellulaire ont été ajoutés dans les réservoirs d'entrée pour éviter leur évaporation. L'intensité de la rhodamine B a été mesurée dans la chambre de culture pendant 15 h à 15 min d'intervalle. Les mesures ont été effectuées dans les mêmes conditions expérimentales utilisées pour les expériences de microscopie de cellules vivantes. Les données ont été traitées à l'aide du logiciel ImageJ.

Pour faciliter le retrait du PDMS, une lame de rasoir à un seul tranchant a été délicatement insérée à l'interface entre le PDMS et la lame de verre tout le long du périmètre de la puce (Fig. 1a supplémentaire). Successivement, la puce PDMS a été pincée pour la décoller de la lame de verre qui scellait les canaux (Fig. 1b supplémentaire). Pour la fixation chimique hors puce, la puce PDMS a d'abord été retirée de la lame de verre. Ensuite, la lame de verre avec les cellules exposées a été rincée avec du PBS puis immergée dans la solution de PFA à 4 % en poids pendant 30 min à température ambiante. La lame a ensuite été rincée avec du PBS et séchée doucement.

Le poly(A)-ARN a été capturé à l'aide de microparticules de poly(T)-résine, comme décrit précédemment par les auteurs dans les réf. 11,28. Le tampon de lyse, avec la composition décrite dans la littérature28, a été dilué 1: 1 dans du PBS 1 × avant de commencer les expériences. Avant chaque cycle d'extraction, une suspension mère de billes dans du tampon de lyse (3000 billes/μL) a été préparée.

La séquence de récupération du contenu de la puce commence avec la puce en mode multi-entrées (10 μL par réservoir, Fig. 2a supplémentaire). Ensuite, le port A est rempli de tampon de lyse (7,5 μL). Dans cette configuration, le tampon de lyse est capable de s'écouler à travers le canal principal mais pas d'entrer dans les chambres. Cependant, pour démarrer la lyse d'une chambre, il suffit de vider le réservoir de la chambre correspondante (Fig. 2b – f supplémentaires). Pour collecter le poly(A)-ARN et le préserver de la dégradation, une aliquote de billes (3 μL) a été placée à chaque port (#1 à #5). Cette quantité était suffisante pour recouvrir la surface inférieure de l'orifice sans créer de contre-pression. Après 10 min, aucune cellule n'était encore visible dans les chambres et le processus de lyse était considéré comme terminé.

Des microparticules de résine ont été récupérées dans chaque chambre réservoir (#1 à #5) et placées dans des tubes de 200 μL. Les microparticules ont ensuite été lavées deux fois avec 100 µL de SSC 6X et une fois avec 100 µL de tampon RT. Toutes les étapes de centrifugation ont été réalisées à 1000 × g pendant 1 min. Les étapes de transcription inverse, d'exonucléase, de PCR et de purification de la banque d'ADNc ont été réalisées comme indiqué dans la littérature28. L'ADNc amplifié a été purifié avec le protocole de billes Ampure XP. Un volume de 0,6 x (volume d'échantillon/volume de billes Ampure XP) de billes Ampure XP a été ajouté à chaque échantillon. Enfin, l'ADNc a été élué dans 10 μL d'eau sans ARNase. L'analyse quantitative et qualitative de chaque échantillon a été réalisée à l'aide d'une puce haute sensibilité TapeStation D5000.

L'analyse d'image et le traitement des données ont été effectués à l'aide d'ImageJ et de Microsoft Excel et les barres d'erreur représentent la médiane ± SD, sauf indication contraire. Les répliques sont biologiques, représentant des expériences sur la même lignée cellulaire mais réalisées à des jours différents. Les expériences ont été répétées au moins trois fois. La taille de l'échantillon variait selon la méthodologie et est définie dans les légendes des figures.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

La conception imprimable de l'adaptateur d'incubateur de scène OkoLab H101 pour le microscope optique Nikon Ti est fournie en tant que "Données supplémentaires 1.dxf". Toutes les données brutes et traitées générées et analysées au cours de l'étude en cours (par exemple, images, tableaux, masques de segmentation) sont fournies sous forme de "Données supplémentaires 2.zip". La tubulure d'endosome chargée de transferrine dans les cellules HK2 est fournie en tant que "Film supplémentaire 1.avi". L'effet d'une contrainte de cisaillement élevée sur les cellules HeLa sur puce est fourni en tant que "Supplementary Movie 2.avi".

Une correction à cet article a été publiée : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04059-4

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Macosko, EZ, Goldman, M. & McCarroll, S. Protocole de laboratoire Drop-Seq ver. 3.1. https://www.protocols.io/view/drop-seq-laboratory-protocol-mkbc4sn (2022).

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Ce travail a été soutenu par la Fondazione Telethon, l'Université de Naples "Federico II" et la Compagnia di San Paolo (STAR Plus 2020 Linea 1) à DdB, le projet COSY-BIO à DdB (EU H2020 grant 766840). GN a été soutenu par "OPL-APPS - IIoT OPEN Platform e Applicazioni per il manufacturing" (subvention PON ARS01_00615) et SC et SB par la Fondation BrightFocus (subvention M2020184). Nous tenons à remercier Giuliano De Carluccio et Alessio Mallozzi pour leur aide à la transfection du plasmide et suggérant l'utilisation d'huile minérale et des expériences sur les cellules CHO-K1, respectivement.

Institut Téléthon de Génétique et de Médecine (TIGEM), Via Campi Flegrei 34, 80078, Pozzuoli, NA, Italie

Giovanni Marco Nocera, Gaetano Viscido, Stefania Criscuolo, Simona Brillante, Fabrizia Carbone, Leopoldo Staiano, Sabrina Carrella & Diego di Bernardo

Département de génie électrique et de technologie de l'information, Université de Naples Federico II, Naples, Italie

Jean-Marc Nocera

CEINGE Advanced Biotechnology, Naples, Italie

Jean-Marc Nocera

Département de génie chimique, des matériaux et de la production industrielle, Université de Naples Federico II, Naples, Italie

Gaetano Viscido & Diego di Bernardo

Institut de recherche génétique et biomédicale, Conseil national de la recherche (CNR), Milan, Italie

Léopold Staiano

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

GMN a conçu le dispositif et effectué et supervisé des expériences. GV, SB et S. Carrella ont effectué des expériences d'immunocoloration. FC et LS ont effectué des essais de recyclage de la transferrine. S. Criscuolo a effectué des expériences de transfection de plasmide. DdB a conçu l'idée et supervisé les travaux. GMN et DdB ont rédigé le manuscrit.

Correspondance à Diego di Bernardo.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Bowei Li, Carla Mulas et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédactrice en chef principale : Eve Rogers.

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Réimpressions et autorisations

Nocera, GM, Viscido, G., Criscuolo, S. et al. La plate-forme VersaLive permet la culture microfluidique de cellules de mammifères pour des applications polyvalentes. Commun Biol 5, 1034 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03976-8

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Reçu : 30 septembre 2021

Accepté : 12 septembre 2022

Publié: 29 septembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-03976-8

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