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Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 184 (2023) Citer cet article

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La microfluidique des gouttelettes offre une plate-forme à partir de laquelle de nouvelles technologies d'analyse moléculaire numérique, de dépistage des maladies, de cicatrisation des plaies et de synthèse de matériaux ont été proposées. Cependant, les technologies commerciales actuelles de génération, d'assemblage et d'imagerie de gouttelettes sont trop coûteuses et trop rigides pour permettre un réglage rapide et à grande échelle des caractéristiques/cargaisons des gouttelettes. Ce goulot d'étranglement de prototypage rapide a limité l'expansion de son application. Ici, un kit de microfluidique de gouttelettes de pipette fait maison peu coûteux est introduit. Ce kit comprend des pointes de pipette elliptiques qui peuvent être fabriquées avec un simple outil de bricolage (à faire soi-même), une puce d'imagerie unique à centre peu profond ou imprimée en 3D qui permet l'assemblage/l'immobilisation et l'imagerie rapides de gouttelettes monocouches avec une caméra de smartphone ou un microscope miniature. Les gouttelettes sont générées par pipetage manuel ou automatique sans pompes microfluidiques coûteuses et liées au laboratoire. La taille des gouttelettes et la viscosité/tension superficielle du fluide peuvent varier considérablement en raison de nos conceptions particulières de génération, d'assemblage et d'imagerie des gouttelettes. La polyvalence de ce kit de prototypage rapide est démontrée avec trois applications représentatives qui peuvent bénéficier d'une plateforme microfluidique de gouttelettes : (1) Gouttelettes en tant que microréacteurs pour la réaction PCR avec transcription inverse pour détecter et quantifier les ARN cibles. (2) Les gouttelettes en tant que microcompartiments pour la culture de la spiruline et les changements optiques de couleur/turbidité des gouttelettes avec la spiruline confirment le succès de la culture photosynthétique. (3) Gouttelettes comme modèles/moules pour la synthèse contrôlée de microgels Janus composites polyacrylamide/or coiffés d'or. Le kit portable facile à fabriquer et convivial est donc parfaitement adapté aux laboratoires de conception, de formation et d'enseignement.

La microfluidique des gouttelettes est devenue un outil puissant pour une variété d'applications multidisciplinaires1,2. Les technologies biotechnologiques commercialisées et proposées passionnantes basées sur la microfluidique de gouttelettes comprennent le dosage unicellulaire3,4, la PCR numérique de gouttelettes5,6, le dépistage rapide du cancer7,8, le dépistage de médicaments ou d'immunothérapie9,10, le dépistage de la sensibilité aux antibiotiques11, les allogreffes d'îlots implantables12,13 etc. 14,15,16,17. Un bon exemple est la réaction en chaîne par polymérase numérique en gouttelettes (ddPCR) qui utilise des gouttelettes comme microréacteurs6,18. En divisant simplement le mélange réactionnel PCR en plusieurs gouttelettes uniformes, les acides nucléiques cibles sont distribués dans les gouttelettes selon la distribution de Poisson et peuvent ensuite être quantifiés à une résolution à copie unique après amplification PCR19. La performance améliorée est renforcée par un grand nombre de gouttelettes (104-106) qui atténue les influences des inhibiteurs ou des non-cibles et permet une quantification absolue sans construction fastidieuse de courbes standard20,21. Un autre exemple est l'encapsulation de cellules/micro-organismes dans des gouttelettes ou des microgels dérivés de gouttelettes qui pourraient fournir de nombreux microcompartiments avec les microenvironnements biophysiques/biochimiques appropriés pour l'étude à haut débit de cellules isolées et de micro-organismes afin d'accélérer le dépistage et l'optimisation à grande échelle même avec une analyse séquentielle permise par les microgels perméables13,22,23,24,25,26,27,28. En plus des applications de microréacteurs et de microcompartiments, des gouttelettes en tant que micro-modèles/moules ont été suggérées pour la synthèse de micro-/nano-matériaux mous et durs29,30,31. La taille miniature contrôlée, la grande surface par unité de volume, le confinement et le grand nombre de gouttelettes permettent une synthèse facile des matériaux avec les structures et fonctionnalités souhaitées en raison des effets de ségrégation et de concentration rapides introduits par un gradient d'hydrophobicité élevé, une forte interaction tensioactif/surface et des effets d'encombrement32,33. La microfluidique des gouttelettes a clairement inspiré plusieurs technologies prometteuses dans de nombreuses disciplines.

Cependant, les systèmes actuels de génération de gouttelettes1,14,34, qui nécessitent souvent des puces/dispositifs sophistiqués et/ou des sources de pression de précision (qui coûtent plus de cinq mille dollars pour les kits commerciaux de génération de gouttelettes de PreciGenome, Elveflow, Fluigent, etc.), ne sont pas suffisamment simples, bon marché et accessibles pour permettre un prototypage et une formation faciles, limitant ainsi la large mise en œuvre des technologies microfluidiques de gouttelettes dans des domaines interdisciplinaires et le développement ultérieur de nouvelles technologies en produits commercialisables. Par exemple, la technologie de génération de gouttelettes à focalisation de flux largement utilisée nécessite un réglage fin avec un contrôle précis des flux biphasiques dans les puces microfluidiques35 et la génération de gouttelettes d'émulsion par étapes relativement insensible au débit nécessite généralement des puces/dispositifs soigneusement conçus avec des terrasses36. Outre la génération de gouttelettes uniformes, les méthodes existantes d'assemblage de gouttelettes basées sur le confinement et d'imagerie au microscope doivent également être simplifiées pour être plus accessibles et personnalisables6,37,38. Par conséquent, un kit d'outils de prototypage simple et rapide qui comprend une technologie de génération de gouttelettes microfluidiques réglables, ainsi que des modules d'assemblage et d'imagerie de gouttelettes robustes qui sont insensibles à la taille des gouttelettes et aux propriétés viscoélastiques, permettrait une expansion supplémentaire de ses applications dans des domaines interdisciplinaires, un peu comme ce que l'impression 3D a fait pour les biopuces et d'autres branches de la microfluidique39. À cette fin, sur la base de notre technologie de gouttelettes de pipette précédemment développée, un kit de formation et de prototypage rapide de microfluidique de gouttelettes de pipette complet standardisé est proposé dans ce travail pour permettre non seulement des caractéristiques de gouttelettes facilement accordables, mais également des composants robustes et peu coûteux qui peuvent assembler, immobiliser et imager des gouttelettes de différentes tailles et avec différentes propriétés rhéologiques et de surface. (Fig. 1).

Kit de microfluidique de gouttelettes de pipette : (1) L'illustration schématique de la modification contrôlable de la pointe de la pipette par un outil de tournevis dynamométrique entraîne des pointes de pipette commerciales déformées avec des parties de tête aplaties. La modification changera l'orifice circulaire d'origine de la pointe de la pipette en un orifice elliptique et le rapport d'aspect de l'orifice elliptique est déterminé par la force de couple du tournevis. (2) Génération de gouttelettes avec les pointes modifiées via un micro pipeteur universel. Des gouttelettes uniformes se pincent automatiquement lors de la distribution manuelle d'une solution aqueuse à travers un orifice de pointe de pipette déformé de manière appropriée dans de l'huile fluorée. (i, ii, iii) Exemples d'applications microfluidiques de gouttelettes typiques concernant (i) la PCR numérique de gouttelettes avec des gouttelettes comme microréacteurs, (ii) la culture de spiruline avec des gouttelettes comme microcompartiments, et (iii) la synthèse contrôlée de microgels avec des gouttelettes comme modèles/moules.

La polyvalence de ce kit robuste est due à trois technologies clés qui peuvent être facilement et rapidement fabriquées pour permettre un réglage maximal. Des microgouttelettes uniformes sont générées de manière pratique en pipetant des liquides à partir de pointes de pipette avec des orifices elliptiques pour un pincement amélioré des gouttelettes. Les pointes de pipette elliptiques sont préparées en déformant les pointes de pipette à orifice rond commerciales avec un tournevis dynamométrique bricolage et la taille des gouttelettes peut être ajustée en modifiant simplement le rapport d'aspect de l'orifice de la pointe de pipette déformée. Les gouttelettes sont emballées et immobilisées contre le centre peu profond d'une puce de ruban adhésif double face facile à fabriquer par un mécanisme d'assemblage de gouttelettes robuste basé sur un flux de mouillage entraîné par la pression capillaire. La suspension de gouttelettes se rapproche d'une géométrie axisymétrique stable avec un ménisque circulaire et confine les gouttelettes à une monocouche circulaire concentrique au centre. L'imagerie des gouttelettes est simplifiée en raison des grosses microgouttelettes immobilisées (300 à 500 microns de diamètre) générées par ce kit, de sorte que les gouttelettes peuvent être imagées par des caméras de smartphone ou observées visuellement. En termes de coût, l'outil de modification de pointe à base de tournevis coûte moins de cent dollars, la pointe de chargement de gel coûte moins d'un centime par pointe, une micro-pipette coûte deux ou trois cents dollars, la puce d'imagerie composée d'une lame de verre et de plusieurs morceaux de ruban adhésif double face coûte moins d'un quart, et l'imagerie peut être effectuée par un smartphone ordinaire à cent dollars (un transilluminateur à mille dollars ou un microscope à fluorescence portable est nécessaire pour l'imagerie par fluorescence). L'ensemble du kit pour la génération, la manipulation et l'imagerie des gouttelettes (y compris l'imagerie par fluorescence) peut être réalisé avec deux mille dollars, ce qui est très rentable par rapport aux kits commerciaux coûtant plus de cinq mille dollars pour la seule partie génération de gouttelettes. De plus, les micro-pipettes, les pointes de pipette, les lames de verre, les rubans polyimide Kapton double face sont des consommables de laboratoire courants et les tournevis dynamométriques, les caméras de smartphone sont des outils courants, ce qui signifie que le kit microfluidique de gouttelettes de pipette proposé ici est extrêmement accessible. La polyvalence du kit est démontrée avec trois applications de prototypage de microfluidique de gouttelettes : (i) des gouttelettes comme microréacteurs pour la PCR numérique de gouttelettes pour détecter et quantifier les ARN cibles ; (ii) des gouttelettes comme microcompartiments pour la culture photosynthétique de la spiruline ; (iii) gouttelettes comme modèles/moules pour la synthèse contrôlée de microgels composites polyacrylamide/or coiffés d'or. Ces exemples typiques démontrent la polyvalence et la convivialité du kit microfluidique de gouttelettes de pipette pour le prototypage rapide et la validation des applications microfluidiques de gouttelettes.

Afin de normaliser la modification de la pointe, une série de forces de couple (directement ajustées et réglées sur un tournevis dynamométrique) ont été utilisées pour produire certaines pressions afin de déformer les pointes de pipette avec différents orifices elliptiques (Fig. 2, "Méthodes": section "Préparation de pointe de pipette elliptique" pour plus de détails sur la façon de construire et d'utiliser l'outil personnalisé pour la fabrication de pointes). La relation entre les rapports d'aspect des orifices de pointe et les forces de couple appliquées est illustrée à la Fig. 3a. Une courbe d'étalonnage comme celle-ci pourrait fournir des conseils pour fabriquer des pointes de pipette elliptiques avec des rapports d'aspect d'orifice souhaités pour un type spécifique de pointes préparées dans les mêmes conditions. L'outil fait maison fournit un canal pour localiser les pointes et les barrières d'intervalle sur la paroi du canal aident à déterminer la longueur de la tête de pointe déformée afin que les conditions de fabrication de la pointe elliptique soient plus reproductibles. (Fig. 2a) De plus, le réglage de la longueur déformée (la longueur de la partie de tête de pointe étant déformée comme indiqué sur la Fig. 2b à droite) permet également une autre façon de régler le degré de déformation de la pointe (Fig. S1).

Modification standardisée des pointes de pipette pour préparer des pointes à tête aplatie. (a) L'outil de déformation de pointe simple est facilement assemblé avec un boîtier imprimé en 3D, deux lames de verre/métal, une pince en acier et un tournevis dynamométrique. Lors de l'utilisation, une pointe de pipette est insérée entre ou sous les deux lames verre/métal. Les lames de verre/métal ne peuvent pas tourner librement une fois assemblées avec le boîtier imprimé en 3D et transfèrent la force de couple à la pression pour déformer la tête de la pointe de pipette commerciale. (b) En réglant le couple sur le tournevis dynamométrique de zéro à vingt, des pointes de pipette modifiées (longueur déformée : ~ 3,5 mm) avec différents degrés de déformation des pièces de tête sont préparées.

Modification contrôlée de la pointe de la pipette en modifiant les forces de couple avec une longueur déformée constante (~ 3,5 mm) et la génération de gouttelettes de pipette correspondante : (a) rapports d'aspect de la section transversale des pointes de pipette par rapport au couple appliqué pour la déformation de la pointe, les longueurs déformées de la pointe sont d'environ 3,5 mm, les images insérées sont des coupes transversales d'orifice de pointe déformées typiques ; (b) rayons moyens des gouttelettes d'eau générées avec des pointes de pipette déformées par couple, chaque point représente le rayon moyen et l'écart type (barre d'erreur) des gouttelettes générées par la pointe déformée correspondante et les images insérées sont des gouttelettes générées par les pointes avec des images en coupe d'orifice insérées dans (a). Sur la base des courbes, des pointes et des gouttelettes spécifiques peuvent être préparées en appliquant les forces de couple correspondantes.

Les pointes déformées avec différentes longueurs déformées et/ou différentes forces de couple sont caractérisées en vérifiant les orifices de pointe (Figs. 2b, 3a, S1a,b, S2a,b). Sous la même force de couple, plus la tête de pointe est courte pour partager la pression, plus la tête de pointe sera déformée (Fig. S1b). De même, sous la même longueur déformée, plus la force de couple appliquée est élevée, plus la tête de pointe sera déformée (Fig. 3a, S2b). De plus, des pointes de propriétés mécaniques différentes (en raison de différents matériaux de pointe, dimensions d'orifice et épaisseur de paroi, etc.) se comporteront et se déformeront différemment sous la pression induite par la même force de couple (Fig. S3a). De ce fait, pour un nouveau type de pointes, une nouvelle courbe d'étalonnage correspondante doit être obtenue via un protocole standard.

Les pointes de pipette déformées sont équipées d'un pipeteur régulier de 20 µL pour la génération de gouttelettes. Techniquement, des gouttelettes uniformes sont générées en mode goutte à goutte à des débits très faibles14. Mais avec des pointes de pipette elliptiques déformées, un pincement automatique des gouttelettes se produit même à un débit élevé en raison du drainage de l'eau du col de pincement par la pression élevée de l'eau du col. Cette pression élevée est due à la courbure azimutale amplifiée à l'extrémité étroite de la section transversale elliptique. La pression capillaire du cou améliorée se traduit par une génération plus robuste et plus rapide de gouttelettes uniformes plus petites similaires à la génération de gouttelettes d'émulsion par étapes à partir de puces microfluidiques avec des canaux à rapport d'aspect élevé41 et la génération de gouttelettes est insensible aux changements de débit modérés, ce qui facilite le pipetage manuel pour générer des gouttelettes uniformes. (Vidéo S1) Comme le montrent les figures (Figs. 3b, 4, S1c, S2c, S3b, S4), plus le rapport d'aspect de l'orifice de la pointe de la pipette est élevé, plus les gouttelettes générées sont petites et uniformes. À partir d'un rapport d'aspect d'environ 3,25, le coefficient de variation (CV) des gouttelettes générées devient inférieur à 5 % et à partir d'un rapport d'aspect d'environ 4, le CV des gouttelettes générées devient inférieur à 2 %. L'uniformité des gouttelettes est comparable aux systèmes de génération de gouttelettes commerciaux, tels que le pack de génération de gouttelettes Elveflow qui revendique un CV de gouttelettes < 3%42. Les grandes non-uniformités des gouttelettes générées avec des pointes à faible rapport d'aspect d'orifice sont dues à deux raisons. Tout d'abord, les gouttelettes générées correspondantes sont plus grosses et les gouttelettes plus grosses sont faciles à décomposer en gouttelettes satellites plus petites lors de la génération et de la manipulation des gouttelettes. Deuxièmement, la génération de gouttelettes avec des pointes moins elliptiques nécessite des débits plus faibles et est plus sensible aux perturbations lors du pipetage. La gamme de gouttelettes de la Fig. 4 peut être encore élargie en utilisant des pointes de pipette de différentes tailles d'orifice (Fig. S5).

Gouttelettes d'eau générées par une série de pointes de pipettes déformées (pointes par défaut de 200 µL utilisées dans ce travail) avec divers rapports d'aspect d'orifice de pointe. Généralement, pour un certain type de pointes, plus le rapport d'aspect de l'orifice de la pointe est élevé, plus les gouttelettes générées sont uniformes.

Une fois les gouttelettes uniformes générées, un autre défi de prototypage est l'assemblage et l'imagerie des gouttelettes. Les gouttelettes d'eau plus légères ont tendance à flotter vers le haut de la phase huileuse dispersée et ne s'assembleraient pas spontanément pour former des monocouches pour l'observation. De plus, l'huile de mouillage éloigne souvent les gouttelettes de la position d'imagerie. Ces problèmes sont généralement résolus avec une conception de puce fermée compliquée avec des piliers et d'autres barrières pour confiner et emballer les gouttelettes en monocouches6,37,38. Épingler la gouttelette en place contre de telles barrières nécessite alors une contre-pression soutenue et le chargement devient une entreprise microfluidique majeure. De plus, le contact avec les barrières solides induit souvent la coalescence des gouttelettes et nécessite donc un flux de chargement précis qui doit être réglé pour des gouttelettes de taille et de viscoélasticité différentes.

La conception à centre peu profond de notre puce d'assemblage permet un assemblage spontané au centre de la puce et permet donc un chargement manuel par une pipette (Fig. 5 et Vidéo S2). L'ensemble de gouttelettes est également épinglé au centre en raison de l'effet de la hauteur du canal incliné sur le débit d'huile de mouillage, même s'ils sont inférieurs à la hauteur du centre. Les gouttelettes ne sont donc jamais en contact avec le mur (Fig. 5b,c et Vidéo S2). Pour minimiser la résistance de la ligne de contact, la ligne de contact de mouillage évoluera d'une forme irrégulière à une forme axisymétrique autour du centre peu profond après le chargement de la suspension gouttelettes/huile. Cet étalement de la ligne de contact est entraîné par l'huile de mouillage qui s'étale sur le substrat. Cependant, l'épinglage de la gouttelette de suspension au centre est dû à la pression capillaire du ménisque concave à la périphérie de la suspension. L'huile de mouillage forme des films minces sur le substrat pour produire un ménisque concave qui supporte une pression d'huile de ménisque négative par rapport à la pression d'air environnante43,44. L'amplitude de la pression capillaire est inversement proportionnelle à la hauteur du canal au niveau du ménisque. Une saillie radialement vers l'extérieur de la suspension se traduira par un ménisque avec un plus grand rayon de courbure à l'extrémité de la saillie, en raison de la plus grande hauteur de canal à cette position. Ce rayon de ménisque plus grand entraîne une pression d'huile de ménisque moins négative et évacue le liquide de la saillie pour arrêter la croissance de la saillie. Une forme radialement axisymétrique au centre est donc approchée par la suspension à huile - elle est épinglée au centre peu profond. Le flux radial lors de cet ajustement vers les packs de symétrie axisymétrique et immobilise les gouttelettes vers le centre peu profond pour former une monocouche circulaire loin de la périphérie du ménisque. Les gouttelettes se déplacent vers le centre, loin du ménisque à la périphérie de la suspension, en raison de la migration induite par le cisaillement par le taux de cisaillement élevé au niveau de la ligne de contact mobile et de la répulsion hydrophobe accrue par le substrat là-bas43. Un cercle de monocouche de gouttelettes assemblées est donc également épinglé au centre peu profond, concentrique à la ligne de contact circulaire (ménisques), même si les gouttelettes sont plus petites que la hauteur de l'espace au centre. La ligne de contact épinglée et la monocouche de gouttelettes restent stables lorsque la pointe est inclinée à plusieurs reprises, permettant ainsi le transport vers l'installation d'imagerie. La hauteur de la chambre du cadre de bande à six couches est sélectionnée pour assembler et immobiliser une seule monocouche de gouttelettes générées par pipette, ce qui simplifie l'imagerie et l'analyse des gouttelettes. Les dimensions de la puce peuvent être modifiées pour accueillir des gouttelettes de différentes tailles et quantités. Tant que l'huile mouille la puce qui a une chambre avec un centre peu profond, les gouttelettes seront épinglées au centre peu profond de la chambre de la puce pour simplifier l'imagerie et la manipulation des gouttelettes. De plus, une encoche pourrait être coupée à un coin du cadre de la bande afin que les pointes de pipette puissent être insérées au centre de la chambre à puce pour le chargement des gouttelettes sans soulever le film de couverture (Fig. S6). En termes de déchargement des gouttelettes de la puce, il s'agit simplement d'un processus inversé de chargement des gouttelettes (Vidéo S3).

Assemblage de gouttelettes et puce d'imagerie en ruban adhésif double face sur une lame de verre : (a) schéma de la puce avec une pointe au coin montrant comment les gouttelettes sont chargées ; (b) charger des gouttelettes dans la puce à partir d'un coin en soulevant le film de couverture ; (c) des gouttelettes monocouches chargées immobilisées dans le centre peu profond de la puce pour une manipulation et une imagerie ultérieures.

La puce à centre peu profond peut également être fabriquée par impression 3D avec une résine transparente qui se mouille à l'huile (Fig. 6). La puce est conçue pour avoir une hauteur inclinée du mur au centre, qui a également une hauteur de canal d'environ 600 microns comme pour la puce à base de bande. Comme prévu, les gouttelettes assemblées restent immobilisées au centre pendant la manipulation et l'imagerie (Fig. 6c). Un problème avec cette puce imprimée en résine 3D est que la puce bloque la fluorescence verte, peut-être à cause des résidus d'initiateur. Ce problème peut être résolu si le moulage par injection est appliqué pour fabriquer la puce à partir de polymères fondus.

Un assemblage de gouttelettes imprimé en 3D et une puce d'imagerie avec une prise assortie : (a) le modèle 3D de la puce et la section transversale pour montrer la conception centrale peu profonde ; (b) une puce imprimée; (c) des gouttelettes monocouches immobilisées à l'intérieur de la puce pour une manipulation et une imagerie ultérieures. Les gouttelettes resteront toujours éloignées des parois à l'intérieur de la puce en raison de la hauteur de la chambre intérieure inclinée vers le centre. La dimension extérieure de la puce d'imagerie de gouttelettes est de 20 mm × 20 mm × 2,5 mm.

Avec un nombre suffisant de microgouttelettes de nanolitre, la détection et la quantification ddPCR d'acides nucléiques uniques sont réalisables. Comme exemple général, le réactif PCR GAPDH humain est utilisé pour détecter et quantifier l'ARN humain. Ici, l'ARN plutôt que l'ADN est choisi comme cible afin que la transcription inverse soit également effectuée. Le kit de réactifs PCR GAPDH humain est largement appliqué dans les laboratoires de bio-ingénierie/biologie comme contrôle endogène de base pour la normalisation d'autres acides nucléiques d'échantillons dans des tests de réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel en masse45,46. Le kit de réactifs PCR GAPDH peu coûteux et les ARN de contrôle humains sont donc idéaux à des fins de formation. Les gouttelettes avec le mélange de réaction PCR floculeront au sommet de l'huile fluorée plus dense dans les tubes PCR ordinaires et auront tendance à fusionner pendant le cycle thermique. Le problème peut être résolu en ajoutant ~ 1 % p/v de F127 à la phase aqueuse en tant que co-tensioactif.

Pour l'imagerie de fluorescence des gouttelettes après ddPCR, deux approches sont proposées pour ce kit. La première consiste à tirer parti d'une caméra de smartphone commune et du transilluminateur qui est fréquemment utilisé dans les laboratoires pour visualiser les gels d'électrophorèse. Étant donné que les gouttelettes générées par le pipetage mesurent généralement plusieurs centaines de microns, elles sont suffisamment grandes pour être observées visuellement et imagées par les caméras des smartphones. Avec un éclairage de lumière bleue et un filtre ambre filtrant du transilluminateur, la fluorescence verte (colorant FAM) des gouttelettes peut être enregistrée (Fig. 7b). Si la combinaison smartphone et transilluminateur n'est pas pratique, une deuxième approche consiste à utiliser un mini microscope à fluorescence portable peu coûteux (Fig. 7d). Les deux méthodes ont été testées après la réaction PCR et les gouttelettes positives (gouttelettes avec des cibles comme indiqué par la forte fluorescence verte amplifiée) sont clairement observables dans les deux cas (Fig. 7). Bien que l'image de fluorescence des gouttelettes prise par le mini microscope portable ait un meilleur contraste (Fig. 7d) que celle prise par la caméra du smartphone (Fig. 7b), le nombre de gouttelettes positives discernables est le même pour les images des deux approches. Par conséquent, des solutions fiables et accessibles sont disponibles pour l'imagerie de la fluorescence des gouttelettes après la réaction ddPCR.

Imagerie de gouttelettes ddPCR par smartphone avec transilluminateur sans (a) ou avec (b) éclairage/filtrage de fluorescence et par mini microscope portable sans (c) ou avec (d) éclairage/filtrage de fluorescence après 40 cycles thermiques. Les gouttelettes sont générées via une pointe de pipette déformée par une force de couple de 20 pouces-livres. Les deux méthodes sont adéquates pour imager correctement les gouttelettes.

L'imagerie efficace de fluorescence des gouttelettes conduit à la quantification des acides nucléiques cibles. À des fins de formation et de prototypage, il est préférable de quantifier en comptant les gouttelettes positives, sans connaître le nombre total de gouttelettes ni en invoquant les statistiques de Poisson. À faible nombre de copies, lorsque les gouttelettes sont nettement plus nombreuses que les cibles, le nombre total de gouttelettes positives est à peu près égal au nombre total de cibles. La quantification positive des gouttelettes nécessite une perte d'échantillon négligeable lors de la génération et de l'imagerie des gouttelettes. Les gouttelettes de nanolitre pipetées répondent à toutes les exigences pour la quantification basée sur le comptage d'échantillons à faible concentration cible. Des expériences répétées sont menées pour plusieurs échantillons à faible concentration cible (0 à 1 picogramme dans 20 µL de mélange réactionnel) et les résultats de quantification basés sur le comptage des gouttelettes positives sont présentés dans le tableau 1 et la figure 8. La relation linéaire indique que la méthode est suffisante pour une quantification approximative et une détection précise des échantillons à faible concentration cible (figure 8). Bien que les écarts-types augmentent à mesure que les concentrations cibles augmentent, le coefficient de variations devient rapidement stable dans la plage de 20 à 30 % (tableau 1) et les variations sont probablement causées par la fluctuation de la concentration cible dans la solution d'échantillon à faible concentration, la variation de volume du micro pipetteur et l'affinité de la molécule cible avec les surfaces du tube PCR et de la pointe de la pipette. De plus, la limite de détection calculée47 basée sur la moyenne des faux positifs, l'écart type des échantillons à blanc et l'écart type des échantillons de concentration non négative la plus faible du tableau 1 (LoD = 0,2 + 1,645*0,45 + 1,645*1,82 = 3,92) est de 3,92 copies par 20 µL de mélange réactionnel, ce qui est comparable aux produits ddPCR commerciaux et indique que la pipette ddPCR est bonne pour une détection précise malgré le comptage La quantification basée sur la valeur ressemble plus à une estimation approximative en raison des variations de 20 à 30 %. (Tableau 1) Bien que l'ARN humain soit utilisé dans cette démonstration, cette technique peut potentiellement être appliquée pour quantifier les ARN viraux et réduire le taux de détection de faux négatifs des tests PCR pour les virus SARS-CoV-2 dans des échantillons hétérogènes48,49. Par conséquent, le kit offre une bonne formation à la PCR numérique de gouttelettes pour la détection et la quantification des acides nucléiques.

Quantification basée sur le comptage positif des gouttelettes d'échantillons à faible concentration cible. Les barres d'erreur sont des écarts-types.

Les microgouttelettes fournissent des microcompartiments et des microenvironnements isolés pour les cellules ou les micro-organismes à habiter et cette fonctionnalité est activement utilisée pour l'analyse/le criblage d'une seule cellule/micro-organisme22,23,24,25 et également pour les usines émergentes de gouttelettes/cellules50,51. Pour bon nombre de ces applications, les gouttelettes offrent une manipulation et un dosage indispensables de cellules individuelles ou de micro-organismes. Par exemple, pour montrer l'encapsulation des gouttelettes avec notre kit proposé, la spiruline à micro-organisme unique est cultivée dans de petites et grandes microgouttelettes à l'intérieur de puces d'imagerie à bande (Fig. 9) ou de tubes PCR (Fig. S7). La spiruline est un type de cyanobactéries comestibles avec une efficacité photosynthétique exceptionnelle qui produit une variété de nutriments et d'ingrédients pour les animaux et les humains. La croissance photosynthétique de la spiruline est vigoureuse car la solubilité élevée en O2/CO2 (10 à 20 fois supérieure à celle de l'eau) dans l'huile fluorée favorise la prolifération des micro-organismes52,53. Avec le temps, la spiruline grandit en nombre et finit par occuper la totalité de la goutte (Fig. 9, S7). Après 10 jours de culture, le taux de prolifération calculé (nombre de gouttelettes avec au moins quatre copies de spiruline / nombre total de gouttelettes avec spiruline) est de 96,9 ± 1,8% à partir de six fois d'expériences. La croissance de la spiruline en microgouttelettes plus petites est relativement plus lente, probablement en raison de l'espace et de l'apport de nutriments plus limités. (Fig. 9a–d, i, j) Le confinement des gouttelettes est efficace et aucune spiruline n'est observée pour diffuser ou se transférer dans d'autres gouttelettes (Fig. 9c,g,j,l). De plus, le confinement des gouttelettes isole et protège la spiruline par les vertus/parois souples (interfaces gouttelettes/huile) formées avec des tensioactifs biocompatibles54. Bien que les gouttelettes puissent rétrécir après des jours de croissance photosynthétique en raison de l'évaporation de l'eau, les grosses microgouttelettes générées par la pipette sont encore assez grandes pour l'imagerie par smartphone et la croissance continue signifie que les micro-organismes de la spiruline sont vivants pendant plus de 10 jours (Fig. 9e – h, S7). Les différences de couleur ou de turbidité causées par la spiruline proliférée dans les gouttelettes positives confirment le succès de la culture et impliquent une quantification numérique des échantillons de micro-organismes à faible concentration après une culture appropriée, comme celles rapportées pour la quantification numérique des gouttelettes de bactéries55.

Culture photosynthétique de spiruline en microgouttelettes petites (a–d) et grandes (e–h) à l'intérieur de puces d'imagerie à base de bande : (a,e) spiruline en gouttelettes telles que générées ; (b,f) spiruline proliférée en gouttelettes positives après 5 jours de culture ; (c,g) spiruline proliférée en gouttelettes positives après 10 jours de culture; (d, h) imagerie sur smartphone des gouttelettes de culture de 10 jours montrant des différences reconnaissables de couleur/turbidité des gouttelettes positives avec la spiruline, en particulier dans les grosses microgouttelettes ; (i–l) images à faible grossissement correspondant respectivement à (a,c,e,g).

Intuitivement, les gouttelettes sont d'excellents modèles/moules pour la synthèse de microgel. Avec l'initiation de la réticulation, les gouttelettes liquides avec les précurseurs de polymérisation de l'acrylamide sont transformées en microgels uniformes (Fig. 10a – d). La transformation liquide en gel en gouttelettes est en outre utilisée pour synthétiser des microgels composites polyacrylamide / or avec des capuchons en or (Fig. 10e – h). L'idée est d'exploiter les différentes échelles de temps cinétiques des réactions de gélification/précipitation et les différentes propriétés physiques de leurs produits pour modéliser les matériaux synthétisés. Généralement, le réseau de gel a un effet de confinement sur la réaction de synthèse intérieure qui non seulement empêche la sédimentation des précipités mais introduit également une adsorption/réaction de surface pour produire des matériaux avec des structures/morphologies distinctes. Par exemple, différentes structures cristallines dans un réseau de liquide et de gel en vrac ont été utilisées pour synthétiser des monocristaux à motifs par incorporation programmable de matériaux étrangers56. Ici, le précurseur de gélification d'acrylamide est mélangé avec du citrate de sodium 100 mM et du chlorure d'or (III) 50 mM et cette solution sera stable pendant environ 6 min avant qu'une réduction notable de l'or ne se produise. La période de temps de 6 min est suffisante pour la génération de gouttelettes de pipette du mélange de 20 µL qui prend habituellement environ 3 min pour terminer. La réduction de l'or dans les gouttelettes en phase liquide générées est rapide et une bonne quantité d'or réduit précipite au fond de chaque gouttelette environ 10 minutes après la génération des gouttelettes (Fig. 10e, f). Avec une exposition aux UV pendant 2 min, les gouttelettes de liquide sont polymérisées et réticulées en microgels, tout en piégeant l'or précipité plus tôt dans l'hémisphère inférieur pour former des capsules d'or sur les microgels (Fig. 10g, h). Après les perturbations (rotation et mouvement) causées par les manipulations ultérieures pour l'imagerie, les bouchons d'or sont orientés de manière aléatoire (Fig. 10h) ce qui indique la formation de microgels car sinon les lacunes d'or précipiteront toutes vers le bas comme dans les gouttelettes de liquide de pré-réticulation (Fig. 10f). De plus, peut-être en raison des effets de confinement et de réduction de l'or de la formation du réseau de polyacrylamide in situ57, l'or nouvellement réduit fusionne immédiatement en nanoparticules d'or dans les nanopores du réseau de gel du microgel lors de la gélification, comme l'indique la couleur rouge vin classique des microgels (Fig. 10g). Cet exemple de synthèse contrôlée de microgels composites polyacrylamide/or coiffés indique que les gouttelettes sont des moules et des modèles prometteurs pour la synthèse de microgels ou de particules à motifs fonctionnels avec les structures et compositions souhaitées33,58.

Synthèse contrôlée de microgels : (a–d) Images de smartphone (a,c) et de microscope (b,d) de deux tailles de microgels de polyacrylamide préparés à partir de mélanges de 20 µL avec différentes pointes de pipette. (e, f) Gouttelettes avec précurseurs de gélification et sources de réduction d'or avant gélification. Dans les gouttelettes en phase liquide, l'or réduit précipitera au fond des gouttelettes en raison de sa densité plus élevée. Les gouttelettes sont réticulées aux UV pour synthétiser les microgels composites polyacrylamide/or coiffés en (g, h). Le processus de gélification UV accélérera également la réduction de l'or et le réseau de polyacrylamide formé in situ confine la croissance de l'or réduit pour produire (g) des microgels rouges remplis de nanoparticules d'or. L'or préalablement précipité au fond de chaque gouttelette de liquide sera fixé en place pour éventuellement préparer (h) des microgels avec des bouchons en or. Les images de (a,c,e,g) sont prises par smartphone tandis que les images de (b,d,f,h) sont prises par un microscope de table.

En résumé, ce travail a fourni un kit de prototypage rapide fait maison pour la microfluidique de gouttelettes qui peut être utilisé par des chercheurs débutants et non experts d'horizons divers. Le flux de travail difficile et délicat de la microfluidique des gouttelettes de génération/assemblage/imagerie des gouttelettes, nécessitant souvent un équipement commercial coûteux et difficile à régler, est simplifié par la génération de gouttelettes de pipette avec des pointes de pipette elliptiques faciles à fabriquer, l'assemblage et l'immobilisation des gouttelettes dans la puce peu profonde (fabriquée avec des bandes ou l'impression 3D) et l'imagerie des gouttelettes par smartphone ou mini microscope portable. Ces conceptions permettent de générer facilement des gouttelettes uniformes de tailles variables et avec un fluide dispersé de viscosité, de tension superficielle et de contenu cellulaire arbitraires. Trois exemples sont choisis et menés pour démontrer les applications polyvalentes de cette plate-forme microfluidique de gouttelettes sur des molécules uniques, des micro-organismes uniques et la synthèse de matériaux avec des gouttelettes utilisées comme microréacteurs, microcompartiments et modèles/moules, respectivement : (i) réaction PCR numérique de gouttelettes dans des gouttelettes pour quantifier les ARN à faible copie au point de besoin sans acheter d'instruments coûteux ; (ii) la culture photosynthétique de la spiruline en gouttelettes ; (iii) synthèse contrôlée de microgels composites polyacrylamide/or coiffés. Bien que les trois exemples ne soient pas approfondis, nous avons démontré que le kit peut être utilisé pour prendre en charge un prototypage et des tests rapides approfondis. Par conséquent, le kit de gouttelettes de pipette devrait faciliter la conception, le prototypage et la formation du personnel des technologies microfluidiques de gouttelettes par des utilisateurs non experts.

Pour normaliser le processus de modification de la pointe, un outil basé sur un tournevis dynamométrique est assemblé. Fondamentalement, l'outil transfère les forces de couple en pressions pour déformer les pointes de pipette. Une pince métallique est associée à un boîtier imprimé en 3D qui empêchera la rotation des lames verre/métal et le mouvement des pointes de pipette lors de la déformation. Un fichier modèle du boîtier imprimé en 3D est fourni dans les informations complémentaires.

Pour la préparation d'une pointe de pipette elliptique, la partie principale d'une pointe à orifice rond régulier (Fisherbrand™ Gel-Loading Tips, 1–200μL, pointes par défaut utilisées dans ce travail si non spécifié) est insérée entre ou sous les deux lames de verre/métal montées sur l'outil de modification de pointe. Le canal sur le boîtier imprimé en 3D aide à localiser les pointes et les barrières d'intervalle sur les parois du canal aident à déterminer la durée d'insertion de la pointe pour la déformation afin que les pointes soient déformées de manière plus contrôlable et reproductible. Une certaine force de couple est directement réglée sur le tournevis dynamométrique et le tournevis est utilisé pour enfoncer la vis sur la pince métallique jusqu'à ce que le couple souhaité soit atteint. Au bout de dix secondes, le couple est relâché et la pointe déformée est retirée. Pendant que le tournevis comprime la pointe, les lames de verre/métal ne peuvent pas tourner librement dans le boîtier imprimé en 3D et donc transformer le couple en pression pour déformer la partie de tête de la pointe de la pipette à la section elliptique souhaitée. Les lames de verre rigides se briseront lorsque la force de couple est supérieure à 20 pouces-livre, et des lames/plaques en métal ou autre matériau plus solides peuvent être utilisées pour déformer les pointes sous des forces de couple de déformation plus élevées.

Pour la mesure des rapports d'aspect de l'orifice de la pointe, des morceaux d'environ 2 mm de long de l'orifice sont coupés des pointes achetées ou déformées par de nouvelles lames de rasoir et les morceaux coupés sont collés verticalement sur du ruban adhésif polyimide Kapton double face avec un côté de la bande déjà attaché à une lame de verre ordinaire. Pour faciliter l'imagerie, les surfaces d'orifice de pointe d'origine sont en contact avec la surface de la bande. Ensuite, les orifices de pointe sur la lame de verre sont imagés au microscope (Olympus IX71) et les deux axes (long et court) des orifices sont mesurés par deux segments de ligne de coordination orthogonaux dans Adobe Illustrator (Fig. S8). En bref, pour une image d'orifice de pointe, une ligne est tracée pour indiquer le grand axe, puis la ligne est copiée en place et pivotée de 90°. La ligne copiée et tournée est ajustée à la longueur de l'axe court de l'orifice (seule la longueur est modifiée, pas de rotation ou de décalage de la ligne afin que les lignes d'axe long et court soient perpendiculaires l'une à l'autre et se croisent au milieu de l'axe long). Enfin, les longueurs des deux lignes sont enregistrées et utilisées pour calculer le rapport d'aspect, à savoir (longueur de l'axe long)/(longueur de l'axe court).

La pointe de pipette à tête aplatie est attachée à une micro pipette régulière de 20 µL. Ensuite, ~ 10 µL d'huile fluorée (HFE 7500 avec 2% en poids de tensioactif RAN-008, RAN Biotechnologies) sont aspirés dans la pointe de la pipette, puis pipetés hors de la pointe dans un tube PCR de 200 µL (Cole-Parmer, article # EW-67103-90) préchargé avec 40 à 50 µL d'huile fluorée. La pointe de la pipette est séchée à l'air pendant environ 50 s. La micropipette avec la pointe déformée est ensuite utilisée pour aspirer le liquide de l'échantillon. La pointe de la pipette avec l'échantillon de liquide est insérée dans l'huile fluorée préchargée de 40 à 50 µL dans le tube PCR de 200 µL. Après quelques secondes, l'huile s'humidifiera à l'intérieur et autour de la surface de l'orifice de la pointe. Dans certains cas (comme avec des liquides d'échantillons visqueux, des pointes très déformées, etc.), l'huile ne mouille pas beaucoup à l'intérieur de la tête de pointe, il serait utile d'ajuster le micro-pipeteur pour augmenter le volume de 0,5 à 1 µL pour faire pénétrer l'huile dans la tête de pointe et mouiller les surfaces internes de la pointe. Après avoir mouillé la tête de la pointe avec de l'huile, l'échantillon de liquide à l'intérieur de la pointe est lentement pipeté dans l'huile pour obtenir un pincement automatique en gouttelettes uniformes. Le débit de pipetage recommandé est inférieur à 10 µL/min. Étant donné que la génération de gouttelettes n'est pas sensible aux petits changements de débit, le pipetage manuel pour obtenir la génération de gouttelettes est possible pour les pointes elliptiques à rapport d'aspect élevé. Une micropipette électrique à débit contrôlé est cependant recommandée pour la génération automatisée de gouttelettes de pipetage.

Notre puce unique à centre peu profond est composée de six couches de ruban polyimide double face commun sur une lame de verre et le dessus est recouvert d'un morceau du film de protection du ruban (doublure de ruban) après avoir découpé une chambre dans le ruban en couches pour le chargement des gouttelettes. Lorsque vous placez le film de protection du ruban (le côté du film initialement en contact avec le ruban est orienté vers le bas et ensuite attaché au cadre du ruban), le film transparent au centre du cadre du ruban est pressé sur la surface de la lame de verre simplement avec le pouce, puis la jupe du film transparent est collée fermement au cadre du ruban. Étant donné que le film transparent au centre est pressé pendant le recouvrement, bien que le film rebondisse un peu après le relâchement de la pression, l'espace entre le film et la lame de verre se rétrécit au centre de la puce de bande (Fig. S9). Il est recommandé d'appuyer fortement le film à la fois le centre sur la surface de la lame de verre et la jupe sur le cadre du ruban pour rendre l'espace central aussi étroit que possible, en particulier pour ne pas que les cadres de ruban adhésif de sorte qu'un centre peu profond soit là même après que le conner se soulève pendant le chargement de l'échantillon. Une fois qu'il y a un centre peu profond, le contrôle très précis de la hauteur de l'espace étroit n'est plus nécessaire. Avant de charger les échantillons, une phase d'huile pure pourrait être utilisée pour tester la puce afin de s'assurer que le centre peu profond pourrait stabiliser l'huile dans le puits central. Si la phase huileuse flotte sur les parois du cadre du ruban, retirez l'huile et refaites l'étape de recouvrement/fixation du film ou faites une nouvelle puce si le cadre du ruban n'est plus adhésif. La dimension de la puce est assez flexible et une puce avec une lame de verre de 75 mm sur 50 mm, un cadre de bande extérieur de 50 mm sur 50 mm et intérieur de 30 mm sur 30 mm et un film de couverture de 56 mm sur 56 mm est recommandé pour les essais initiaux (Fig. 5a). Comme mentionné, la hauteur de l'écart au centre de la puce à base de ruban à six couches est d'environ 600 microns, ce qui peut être estimé approximativement par les diamètres extérieurs (OD) de certaines pointes de pipette comme la pointe de 0,57 mm OD utilisée pour le chargement des gouttelettes dans ce travail. Un certain ajustement de la hauteur centrale réduite de la chambre en utilisant moins de couches de ruban peut être nécessaire pour les gouttelettes plus petites. La puce est réutilisable jusqu'à ce que le cadre de bande ne soit plus suffisamment adhésif pour maintenir une structure de chambre centrale peu profonde. Le ruban adhésif double face super adhésif est recommandé pour des puces plus durables. Deux couches de chambre de joint de cadre PCR coûteuse (Bio-Rad, 15 × 15 mm, 65 µL #SLF0601) pourraient être utilisées pour fabriquer la puce d'imagerie à la place si la découpe d'une chambre dans le ruban polyimide à six couches pose un problème.

La puce d'assemblage à centre peu profond peut également être imprimée en 3D au lieu d'être fabriquée par la méthode de ruban adhésif ci-dessus. La puce est conçue par un logiciel en ligne gratuit (Tinkercad) et imprimée par une imprimante 3D à résine populaire bon marché (ELEGOO Mars 2 Pro) avec une résine transparente (Siraya Tech Blu 3D Printer Resin Clear V2). Le modèle 3D est tranché par un logiciel gratuit (CHITUBOX Basic) avec un temps d'exposition de 4 s, un temps d'exposition inférieur de 40 s, une distance de levage de 8 mm, une hauteur de couche d'impression de 50 µm, une vitesse de levage de 80 mm/min et une vitesse de rétractation de 210 mm/min. Après l'impression, la puce est lavée avec une solution de résine à 25–50 % dans de l'alcool isopropylique (IPA). Le lavage à l'IPA pur n'est pas recommandé car il nettoierait excessivement la puce incomplètement réticulée et rendrait les surfaces de la puce rugueuses et moins transparentes. La puce propre est séchée aux UV quatre fois à une exposition de 5 minutes dans une boîte de séchage (ELEGOO Mercury Plus 2 en 1 Washing and Curing Station V2.0) avant utilisation.

Une pointe de pipette à orifice rond du commerce (pointes de pipette à chargement de gel VWR®, 1 à 200 µl, pointe ronde, diamètre extérieur de 0,57 mm) est utilisée pour aspirer la suspension gouttelettes/huile du récipient. La pipette délivre ensuite la suspension au centre de la puce d'imagerie à travers un coin de la puce de film adhésif en soulevant légèrement le film de couverture à ce coin (voir la vidéo dans les informations complémentaires). En variante, une encoche peut être découpée dans le cadre de bande à un coin pour insérer la pointe à travers l'encoche jusqu'au centre de la puce d'imagerie sans soulever le film de couverture. Une entrée de pipette est fabriquée pour la puce imprimée en 3D dans le même but. Surtout, en raison de la structure centrale peu profonde (hauteur réduite), la suspension ne coulera pas librement malgré l'huile de mouillage. Au lieu de cela, il sera épinglé au centre de la puce d'imagerie pour une imagerie optique pratique par un smartphone (OnePlus 7 Pro) ou un microscope (Olympus IX71). Les images au microscope sont utilisées pour l'analyse de la taille et de l'uniformité des gouttelettes afin de valider les performances de génération de gouttelettes de la pipette. En bref, une échelle est définie dans ImageJ en fonction de la barre d'échelle du microscope, puis les zones de projection des gouttelettes individuelles sont mesurées pour calculer le rayon de chaque gouttelette. Étant donné que la hauteur de la chambre de la puce d'imagerie est d'environ 600 µm, les gouttelettes plus grandes que cela peuvent s'aplatir un peu lorsqu'elles sont chargées et assemblées à l'intérieur de la puce d'imagerie, produisant ainsi des zones de projection accrues et par la suite des rayons accrus par rapport à la normale.

Pour l'imagerie par fluorescence, la puce avec des gouttelettes est placée sur un transilluminateur de lumière bleue (Clare Chemical Research), puis un filtre ambre est placé au-dessus de la puce d'imagerie. La fluorescence des gouttelettes est imagée avec un smartphone dans des circonstances sombres ou sombres après réglage sur le transilluminateur. Si un transilluminateur n'est pas disponible, un mini microscope à fluorescence portable abordable (Dino-Lite AM4115T-GFBW) est recommandé pour l'imagerie des gouttelettes.

Un mélange réactionnel typique est préparé avec 5 µL Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix (New England Biolabs, Catalogue # M3019S), 1 µL d'amorces et de sondes GAPDH humaines (Thermo Fisher Scientific, Catalogue # 4333764 T), 2 µL de solution aqueuse de F127 à 10 % p/v, 0 à 10 µL d'ARN de contrôle humain dilué (Thermo Fisher Scientific, Catalogue # 4 307, 281) comme cible et 12–2 µL d'eau sans nucléase pour obtenir un volume total de mélange de 20 µL. Les réactifs congelés sont fondus sur de la glace et mélangés par pipetage avant utilisation et sont remis au réfrigérateur immédiatement après utilisation. La solution aqueuse de F127 à 10 % p/v est préparée en dissolvant 0,1 g de poudre de F127 (Sigma-Aldrich, BioReagent, catalogue n° P2443-250G) dans 1 ml d'eau froide sans nucléase (Thermo Fisher Scientific, catalogue n° R0582) et la solution est conservée à 4 °C. Une fois le mélange réactionnel terminé, des gouttelettes uniformes sont générées dans des tubes PCR comme mentionné précédemment. Le tube PCR avec des gouttelettes de mélange réactionnel est immédiatement placé dans un thermocycleur portable (Bio-Rad, MJ Mini Thermal Cycler) pour une réaction PCR avec un protocole de transcription inverse de 10 min à 52 °C, dénaturation de 2 min à 95 °C, 40 cycles de 10 s à 95 °C et 30 s à 60 °C.

La spiruline (ACAp-01003) et le kit complet de milieux de culture correspondant (sels + nutriments, MKAp-00001) proviennent d'Algae Research Supply. Le milieu de culture est préparé en dissolvant les sels et les nutriments dans une certaine quantité d'eau recommandée par le fournisseur. La suspension de spiruline est ensuite diluée avec le milieu de culture aux concentrations souhaitées. La spiruline bien mélangée et les milieux de culture sont dispersés en gouttelettes en pipetant la génération de gouttelettes avec une pointe elliptique déformée par une force de couple de 20 pouces-livres. Après avoir encapsulé le micro-organisme, les gouttelettes (chargées dans des puces d'imagerie à bande double face ou dans des tubes PCR de 200 µL, avec l'huile de génération de gouttelettes) sont placées sur un rebord de fenêtre avec la lumière du soleil pour la croissance et la prolifération de la spiruline. Le coin de la puce d'imagerie et le bouchon du tube PCR sont ouverts une fois par jour pendant environ 1 min à des fins d'échange gazeux lors de la culture de la spiruline en gouttelettes. Dans ces conditions, le cycle de vie de la spiruline est de 2 à 3 semaines.

Pour la préparation de microgel de polyacrylamide, 5 µL de solution de monomère et d'agent de réticulation (Acrylamide : Bis-Acrylamide 29:1, solution à 40 %, Fisher BioReagents, BP1408-1) sont mélangés avec 13 µL d'eau déminéralisée et 2 µL de solution d'initiateur à 2 % p/v. La solution d'initiateur à 2 % p/v est préparée en dissolvant 10 mg de poudre de phényl-2,4,6-triméthylbenzoylphosphinate de lithium (LAP, Sigma-Aldrich, 900,889-1G) dans 500 µL d'eau et le tube contenant la solution est enveloppé par une feuille d'aluminium et placé dans l'obscurité lorsqu'il n'est pas utilisé. Le mélange précurseur de 20 µL résultant est généré en gouttelettes par pipetage avec une pointe elliptique déformée par une force de couple de 20 pouces-livres. Outre cette pointe de pipette, un autre type de pointe (pointe de microchargeur Eppendorf) avec une taille d'orifice réduite est également déformée par la même force et utilisée pour générer des gouttelettes de plus petite taille. Les gouttelettes générées sont transformées en microgels uniformes après 2 min d'irradiation dans une boîte UV (Electro-Lite, Electro-Cure 500).

Pour la synthèse contrôlée de microgels composites polyacrylamide/or avec des bouchons en or, la solution est préparée avec 10 µL d'eau, 5 µL de solution de monomère et d'agent de réticulation (Acrylamide : Bis-Acrylamide 29:1, Solution à 40 %, Fisher BioReagents, BP1408-1), 2 µL de solution d'initiateur LAP à 2 % p/v, 2 µL de citrate de sodium 1 M (Sigma-Aldrich, W 302600-1 KG-K) et 1 µL de solution de chlorure d'or 1 M (Sigma-Aldrich, 520,918-1G). Après avoir bien mélangé, la solution est immédiatement générée en gouttelettes par pipetage avec une pointe elliptique déformée par une force de couple de 20 pouces-livres. L'or nouvellement réduit précipitera au fond de chaque gouttelette. Dix minutes plus tard, les gouttelettes sont réticulées pour former des microgels en les plaçant dans une boîte UV pendant 2 min. Le processus de gélification fixera l'or précipité en place pour former des bouchons sur les microgels uniformes.

Les auteurs déclarent que toutes les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles dans le document et les informations supplémentaires.

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Ce travail a été soutenu par le Fonds commun des NIH, par l'intermédiaire du Bureau de la coordination stratégique/Bureau du directeur des NIH, 4UH3CA241684-03. Les auteurs reconnaissent le cours de développement d'instrumentation enseigné par le professeur Jeffrey Kantor à l'Université de Notre Dame.

Département de génie chimique et biomoléculaire, Université de Notre Dame, Notre Dame, IN, 46556, États-Unis

Liao Chen, Chenguang Zhang, Vivek Yadav, Angela Wong, Satyajyoti Senapati et Hsueh-Chia Chang

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LC a initié, conçu et réalisé les travaux. H.-CC a conseillé les travaux. H.-CC et SS ont acquis le financement et géré le projet. CZ a contribué à l'effort d'impression 3D et VY a aidé à l'analyse de l'image des gouttelettes. AW a aidé à tester la PCR numérique de gouttelettes de pipette en tant qu'étudiant en génie de premier cycle. LC et H.-CC ont rédigé l'article avec les contributions de tous les auteurs.

Correspondance à Hsueh-Chia Chang.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Chen, L., Zhang, C., Yadav, V. et al. Un kit de prototypage rapide et de formation en microfluidique de gouttelettes de pipette fait maison pour la PCR numérique, l'encapsulation de micro-organismes/cellules et la synthèse contrôlée de microgels. Sci Rep 13, 184 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-27470-1

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Reçu : 26 mai 2022

Accepté : 02 janvier 2023

Publié: 05 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-27470-1

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